Regulación de la expresión del programa de germinación en semillas de soja - Montechiarini, Nidia H. (2018)
La germinación de las semillas es un proceso expansivo, definido por el ingreso de agua a los ejes embrionales y es visualizado como la protrusión radicular a través de las envolturas seminales. Los mecanismos fisiológicos y moleculares que controlan la germinación de las semillas de soja (Glycne max (L.) Merr.), y especialmente el rol del Ácido Abscísico (ABA) sobre dicho proceso, constituyen el núcleo principal del presente trabajo. Los ejes inmaduros, entre 25 y 40 días después de antesis (DDA), poseen elevadas concentraciones de ABA ([ABA]e), las cuales descienden a valores no inhibitorios hacia la madurez. Presentan en consecuencia, restricciones para germinar, con tasas de germinación in vitro crecientes con la edad. Por otra parte, los ejes embrionales maduros (45 DDA, madurez fisiológica y >60 DDA, maduros y secos) no están intrínsecamente inhibidos por la [ABA]e para germinar, aunque la germinación puede ser bloqueada bajo incubación en presencia de ABA exógeno. En base a estos conocimientos, ejes embrionales de semillas de soja, cosechadas entre los 25 y >60 DDA, constituyeron un modelo experimental adecuado para establecer relaciones causa-efecto entre el ABA y el/los posible/s responsable/s metabólico/s que participa/n de la germinación y es/son controlado/s por éste. Al mismo tiempo, permitieron centrar el foco de estudio en el órgano primario implicado en la germinación, sin tener en cuenta los demás órganos seminales que no cumplen roles decisivos en este proceso. La [ABA]e se cuantificó mediante radioinmunoanálisis, utilizando el anticuerpo monoclonal DBPA1. Para los análisis moleculares se tuvieron en cuenta dos regiones del eje embrional, una de ellas consideró a ambos extremos (plúmula + radícula) y la otra, definida como "Zona de Elongación", ZE, comprendió la porción del hipocótilo, cuyas células experimentan estrictamente la expansión, constituyendo por lo tanto, la zona principal de estudio. Se evaluó la germinación de ejes embrionales en agua destilada, y en diferentes medios de incubación. La naturaleza expansiva de la germinación fue evaluada a través del control por restricción osmótica durante la imbibición en soluciones de Polietilenglicol 8000 (PEG). La incubación en buffer pH8 tuvo por objetivo inhibir el "crecimiento ácido" descripto como evento inicial responsable del alargamiento celular durante la germinación. El control por ABA sobre las paredes celulares, impidiendo que éstas se relajen, evitando la expansión y el alargamiento del eje embrional, fue evaluado a partir de incubaciones en presencia de la hormona. La estrategia de búsqueda se orientó a identificar secuencias Expansinas, cuya actividad óptima a pH~4 es indicada sobre el crecimiento ácido de paredes celulares vegetales, resultando por lo tanto responsables primarias de la remodelación de las paredes celulares en la ZE que da lugar al proceso expansivo durante la germinación. Se evaluó la presencia de Expansinas a nivel de ADN genómico. Posteriormente, se amplificó y secuenció un fragmento (EXPAI-like) a partir de ARN mensajero (ARNm) de la ZE de ejes embrionales germinados en agua destilada, el cual presentó una alta homología con la Expansina 1 de soja. Los análisis de expresión se realizaron por la técnica de Transcripción Reversa seguida de Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa, en un único paso, semicuantitativa (RT-PCR) y en dos pasos, cuantitativa y en Tiempo Real (RT-qPCR). Los resultados mostraron la presencia de EXPAI-like mayoritariamente en la ZE de los ejes embrionales, e indicaron tanto que hubo represión por ABA y pH18 como inducción en agua destilada y PEG. Adicionalmente, la presencia del transcripto aún en ejes sin incubación determinó que EXPAI-like forma parte de las biomoléculas almacenadas en el eje embrional de la semilla de soja durante su formación. Estudios complementarios mostraron que, en presencia de un inhibidor transcripcional (a-Amanitina), los ejes embrionales germinaron, aunque a menor tasa y porcentaje que en agua destilada; en tanto no germinaron cuando la traducción fue inhibida en Cicioheximida, indicando que la germinación es posible a partir de los ARNm acumulados durante el desarrollo. Por otra parte, se registró un incremento de expresión progresiva de EXPAI-like en la ZE de ejes embrionales de 25 a >60 DDA, el cual se relacionó con la [ABA]e decreciente a través del desarrollo. Similarmente, tanto el incremento de EXPAI-like como la caída de [ABA]e ocurrieron durante la incubación en condiciones de germinación para cada edad. A partir de estos resultados se postula que EXPAI-like participaría de los eventos moleculares decisivos durante la germinación en soja, permitiendo el relajamiento de paredes celulares necesario para que la misma ocurra. Por su parte, la [ABA]e operaría reprimiendo tanto la síntesis del transcripto EXPAI-like como los eventos moleculares aguas abajo del mismo.