Desarrollo de herramientas para la producción de proteínas recombinantes en Corynebacterium glutamicum - Ravasi, Pablo (2016)
El uso de herramientas de biología sintética permite realizar una contribución significativa para el avance de la ingeniería genética, mediante la reducción de los tiempos de desarrollo de organismos recombinantes. Sin embargo, la mayoría de las herramientas de biología sintética has sido obtenidas para E. coli. En este proyecto se ha desarrollado una plataforma para modificar genéticamente de manera rápida un microorganismo de alto interés industrial como C. glutamicum. En este trabajo fue diseñado un vector sintético denominado pTGR, en el cual todos sus componentes se encuentran flanqueados por sitios de restricción únicos. El mismo permite el rápido intercambio de secuencias regulatorias así como la obtención de construcciones que permiten la expresión de varios genes simultáneamente. La plataforma que provee el sistema del pTGR contribuye a la exploración de partes involucradas en la expresión génica y facilita el rápido ensamblado de circuitos genéticos el cual permite realizar ingeniería metabólica en C. glutamicum. El sistema fue validado utilizando genes reporteros para ensayar promotores y RBSs y para el ensamblado de operones duales y clústers que contienen dos unidades transcripcionales. Por otro lado se estudiaron estrategias alternativas, que no dependen de elementos reguladores de la transcripción. En este sentido, se determinó que tanto la variación la concentración del inductor así como el intercambio de orígenes de replicación con distinto número de copias, también pueden ser utilizados como herramientas para regular los niveles de expresión de proteínas recombinantes en C. glutamicum. Utilizando las ventajas que provee la plataforma pTGR se estudiaron distintas secuencias de secreción del sistema Tat en C. glutamicum reportadas en la bibliografía, demostrando que la correspondiente a la proteína PhoD de B. subtilis resultó la más eficiente al momento de secretar el gen reportero mCherry. Además, aprovechando la versatilidad que brinda esta herramienta, se sobre-expresaron los traslocadores de la vía Tat, desde el vector pTGR, demostrando que es posible lograr un aumento de la eficiencia de secreción mediante esta estrategia. A continuación se busco emplear la herramienta genética creada para su utilización en sistemas de expresión de proteínas de interés industrial. Así, se utilizaron diferentes péptidos señales evaluados con el sistema pTGR para expresar y secretar la fosfolipasa C de B. cereus (BC-PLC). Esta enzima es un candidato atractivo para el proceso de desgomado enzimático, de aceites consumibles, debido a su capacidad de degradar fosfolípidos. Durante el refinamiento del aceite los fosfolípidos capturan los triacilglicéridos disminuyendo el rendimiento del proceso. Entre las distintas secuencias señales ensayadas, la salvaje de la BC-PLC que utiliza la vía general Sec, fue la que demostró la mayor eficiencia de secreción. A partir de la misma se obtuvieron 0.12 g/L de enzima en sobrenadante de cultivos en Batch de C. glutamicum. En la última etapa del trabajo con el fin de obtener un proceso industrial económicamente viable para la manufactura de la BC-PLC, se evaluó un proceso de Fed-batch a partir de la cepa de C. glutamicum previamente desarrollada para la producción y secreción de esta enzima. Utilizando un medio semi definido y una estrategia de alimentación con flujos escalonados, se alcanzó una concentración final de 5.5 g/L luego de 55 h de proceso. La misma corresponde a una productividad volumétrica de 0.1 g/L.h, siendo hasta el momento el valor más alto reportado de expresión de una enzima heteróloga en esta especie. Finalmente a partir de ensayos de RMN, se demostró que la enzima recombinante fue capaz de hidrolizar completamente los fosfolípidos mayoritarios del aceite crudo de soja fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, demostrando su capacidad para el proceso de desgomado enzimático.