Identificación y caracterización de mecanismos de resistencia a herbicidas inhibidores de la enzima acetohidroxiácido sintasa en girasol

• Autores: Gil, Mercedes
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Picardi, Liliana A.; Nestares, Graciela M.; Felitti, Silvina
• Materia: Helianthus annus; Girasol; Resistencia a los herbicidas; Imazetapir; Imidazolinonas
• Institución: Universidad Nacional de Rosario

Imidazolinone (IMI) resistance genes have been introgressed from a sunflower wiid population collected in Kansas to elite inbred lines. A digenic model has been proposed as the genetic basis of the inheritance of IMI resistance. This model assumes that both parents must express two resistance genes to achieve complete resistance in the hybrids: the major semidominant locus lmr1, an allelic variant of the ahas1 locus that codes for the acetohydroxyacid synthase catalytic subunit and the modifier locus lmr2, whose effect remains unknown and it could be related to non-target-site resistance such as xenobiotic metabolism. The objective of this study was to identify and characterize IMI resistance mechanisms in sunflower. Specific objectives were: 1- Evalúate the growth response to imazetapyr in combination with P450s inhibitor piperonyl butoxide (PBO) ¡n sunflower plantlets. 2- Evaluate the growth response to imazetapyr ¡n combination with P450s inhibitor 1-aminobenzotriazole (ABT) in sunflower plantlets. 3- Characterize sunflower gene expression in response to imazetapyr using cDNA-AFLP. 3.1- Determine the optimal herbicide concentration known as discríminating dose. 3.2- Determine optimal herbicide treatment length. 3.3- Determine acetohydroxyacid synthase in vitro activity to assess enzyme inhibition levéis. 4- Characterize resistant sunflower gene expression in response to imazetapyr using TruSeq Stranded RNA-Seq. Two sunflower inbred lines were used ¡n this study: HA 425 and HA 89, classified as resistant (lmr1lmr1lmr2lmr2) and susceptible (¡mr1imr1imr2imr2), respectively. An important number of xenobiotic metabolism related genes were found in cDNA-AFLP and RNA-Seq transcriptomic analysis: cytochromes P450, ABC transporters, glycosyitransferases, UDPglucuronosyl/glucosyItransferases and glutathione S-transferases. This results combined with increased phytotoxicity of imazetapyr ¡n the resistant line when P450s inhibitors were present, agree with suggestions previously made that non-target-site resistance mechanisms may contribute to herbicide resistance ¡n sunflower. Moreover, these mechanisms could be related to the modifier locus lmr2. This study allowed to detect constitutively expressed detoxification genes potentially related to imidazolinone resistance in sunflower and encourage further experimentation on the molecular and biochemical levels to asses the role of P450s in endowing herbicide resistance.
En el año 1998 se encontró en Kansas, Estados Unidos, una población de girasol maleza (Helianthus annuus L.) resistente a herbicidas imidazolinonas (IMI) y esta fuente de resistencia denominada Imisun pudo ser incorporada al girasol cultivado mediante cruzamientos convencionales. Se ha demostrado a través de una aproximación de la genética clásica que esta resistencia está controlada por dos loci: un locus principal con acción semidominante (Imr1) que se corresponde con una mutación en el codón 205 del locus que codifica para la enzima acetohidroxiácido sintasa (AHAS) y un segundo locus (Imr2) de efecto modificador, cuya identidad se desconoce pero que podría corresponder a determinantes génicos adicionales involucrados en el metabolismo del herbicida. La detoxificación de xenobióticos usualmente se asocia a familias de enzimas tales como glutatión S-transferasas (GSTs), glicosiltransferasas y citocromo P450 monooxigenasas (P450s). La hipótesis del presente trabajo es que existen genes asociados a la presencia del locus Imr2 que están involucrados en la eficiencia de metabolismo y detoxificación del herbicida imazetapir en la fuente de resistencia Imisun de la especie girasol. El objetivo general fue Identificar y caracterizar mecanismos de resistencia al herbicida imazetapir en la fuente de resistencia Imisun de la especie girasol y los objetivos específicos fueron los siguientes: 1- Evaluar el efecto del inhibidor de citocromos P450 piperonil butóxido (PBO) sobre la resistencia al herbicida imazetapir en plantas completas de girasol. 2- Evaluar el efecto del inhibidor de citocromos P450 1-aminobenzotriazol (ABT) sobre la resistencia al herbicida imazetapir en plantas completas de girasol. 3- Caracterizar el transcriptoma de dos genotipos de girasol resistente y susceptible a imidazolinonas, respectivamente y su respuesta al tratamiento con imazetapir mediante la técnica cDNA-AFLP. 3.1-Determinar la concentración de herbicida imazetapir óptima para el estudio del transcriptoma. 3.2- Determinar los tiempos de colecta post tratamiento con herbicida adecuados para el estudio del transcriptoma. 3.3- Evaluar los niveles de inhibición de la actividad AHAS in vitro durante los tiempos de colecta. 4- Analizar las diferencias en los niveles de expresión génica para el genotipo resistente en respuesta al tratamiento con imazetapir mediante la técnica TruSeq Stranded RNA-Seq. Para los ensayos de reversión de la resistencia en plantas completas se utilizaron dos líneas endocriadas de girasol resistente (R) y susceptible (S) a IMI, el herbicida imazetapir y los inhibidores de P450s PBO y ABT. Las variables evaluadas sobre plantas de 15 días fueron: área total foliar total (AFT), longitud de raíz principal (LP), longitud de la raíz lateral más larga (LL), longitud de hipocótilo (LH) y índice de coloración de las hojas hue, mediante programas de análisis de imágenes digitales. Los contrastes ortogonales detectaron diferencias significativas en algunos tratamientos para el inhibidor PBO en las variables AFT y LL en el genotipo R y los valores del índice de reducción atribuida al PBO fueron de 26 %, 23 %, respectivamente. En el caso del inhibidor ABT se encontró efecto significativo del mismo para las variables LP y LL en el genotipo R y los valores del índice de reducción atribuida al inhibidor fueron de 13 % y 11 %, respectivamente. Estos resultados sugieren que en la fuente de resistencia Imisun existiría un mecanismo de detoxificación mediado por isoformas de P450s particularmente inhibidas por ABT y PBO. Para el análisis de estudio del transcriptoma se utilizaron las dos líneas endocriadas de girasol R y S y el herbicida imazetapir. La concentración óptima de trabajo de imazetapir fue 1 μM y los tiempos de colecta adecuados para el análisis del transcriptoma fueron 12, 18 y 24 hs. Se confirmó la inhibición de AHAS en los tiempos de colecta elegidos, se eligió la combinación óptima de enzimas de restricción CviAII y MseI mediante un análisis in silico y se realizó el ensayo de cDNA-AFLP. Se aislaron, re-amplificaron y secuenciaron 49 fragmentos diferencialmente expresados cuyas potenciales categorías funcionales se asignaron mediante búsquedas BLAST contra bases de datos NCBI y contra el transcriptoma ensamblado de novo HaT13I. Dieciocho secuencias aisladas en diferentes tiempos de colecta, tratamientos y genotipo estarían relacionadas a procesos de detoxificación y estrés hídrico. El análisis TruSeq Stranded RNA-Seq se realizó sobre plantas R control y tratadas con imazetapir 1 μM y para el mapeo se utilizó como referencia el transcriptoma HaT13I. Se realizó una búsqueda específica de familias de genes relacionados con procesos de detoxificación de xenobióticos. Ninguno mostró expresión diferencial. Los resultados de este trabajo de tesis sugieren que el metabolismo de herbicidas en la fuente de resistencia estudiada es de expresión constitutiva, puede ser detectado en el genotipo susceptible y la resistencia aparece como resultado de un aumento de dicho metabolismo en un momento determinado del tratamiento con IMI. Estos mecanismos de resistencia no relacionados al sitio de acción podrían contribuir a la resistencia a imidazolinonas en girasol y estar relacionados al locus Imr2.
Fil: Gil, Mercedes. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias. Argentina