Desarrollo de metodologías bioseparativas que emplean polímeros de cadena flexible y macroligandos de afinidad : su aplicación al aislamiento de fitoproceasas de uso industrial - Rocha, María Victoria (2016)
En el presente trabajo de tesis se abordó el estudio del aislamiento, a partir de sus fuentes naturales, de dos fitoproteasas de aplicación industrial: bromelina (BR) y papaína (PAP). Para ello se propuso combinar dos estrategias bioseparativas de bajo impacto: el reparto de afinidad en sistemas bifásicos acuosos (SBAs) formados por polietilenglicol y citrato de sodio (PEG/NaCit), empleando alginato como macroligando, seguido de la precipitación de afinidad, metodología que aprovecha la capacidad del alginato de gelificar reversiblemente en presencia de iones calcio. Ambas metodologías comparten ciertas ventajas: son sencillas, rápidas, económicas, escalables y no requieren de instrumental sofisticado. Como punto de partida del desarrollo bioseparativo propuesto, se estudiaron las interacciones entre las enzimas de interés y los polímeros de fase (polietilenglicoles) y de afinidad (alginato) a fin de lograr la identificación y caracterización de las posibles fuerzas intermoleculares involucradas. Mediante la aplicación de técnicas basadas en propiedades espectroscópicas, hidrodinámicas y calorimétricas, fue posible inferir una diferenciación de los polímeros utilizados, agrupándolos en dos clases según sus comportamientos frente a las proteasas: i) los de mayor peso molecular (PEG2000, PEG4600 y PEG8000) y ii) los de menor peso molecular (PEG600 y PEG1000) y el alginato de sodio. Con respecto a los primeros, los efectos observados indicaron que los mencionados PEGs se excluyen preferencialmente de la superficie proteica por un mecanismo de tipo estérico, no afectándose significativamente el contenido de estructura secundaria de las fitoproteasas. Por su parte, los PEGs más pequeños y el alginato ocasionaron alteraciones que evidenciaron su unión preferencial a las fitoproteasas. En el caso del alginato, las perturbaciones fueron más marcadas, sugiriendo la existencia de interacciones fuertes y específicas entre este polímero y las proteínas. El estudio del reparto de BR y PAP comerciales en los diferentes sistemas PEG/NaCit mostró un desplazamiento del equilibrio de reparto de ambas proteasas hacia la fase salina a medida que aumentaba el tamaño del polímero empleado. A pesar de que ambas enzimas presentan características fisicoquímicas semejantes (peso molecular, punto isoeléctrico, etc.) sus perfiles de reparto reflejaron comportamientos disímiles, evidenciando BR una mayor tendencia que PAP a distribuirse hacia la fase rica en PEG. Esta conducta también fue observada cuando se ensayó el reparto de las fitoproteasas presentes en el extracto de tallo de ananá y en el látex de papaya. En dicho caso, el análisis del proceso separativo/extractivo de BR, mostró a los SBAs formados por PEG2000, PEG4600 y PEG8000 como los de mejor performance, ya que permitieron recuperar mayoritariamente a la enzima en fase salina, con rendimientos cercanos al 90% y factores de purificación de 2,0-2,5, indicadores que pueden considerarse aceptables para una primera etapa de recuperación de la enzima. Cuando se trabajó con el látex de papaya, los resultados fueron poco satisfactorios ya que, si bien todos los sistemas permitieron recuperar la PAP en forma significativa en la fase inferior con rendimientos mayores al 60%, los valores del factor de purificación apenas superaron la unidad. Excepcionalmente, el sistema formado por PEG8000 demostró una buena capacidad de purificación (FP 2,50) en la fase polimérica pero con bajo rendimiento (20%). Como estrategia posible para mejorar el desempeño del proceso extractivo, se evaluó la inclusión de alginato como ligando de afinidad en los SBAs. Este polímero se repartió mayoritariamente hacia la fase superior, rica en PEG, y su presencia, en concentraciones adecuadas (0,1-0,3 %P/P), direccionó a BR y PAP hacia dicha fase, mejorando considerablemente los rendimientos. Estos resultados, junto con la determinación de las condiciones óptimas de formación de los geles de alginato y su redisolución, permitieron diseñar una estrategia integrada (reparto + precipitación de afinidad) para recuperar las fitoproteasas a partir de sus respectivas fuentes naturales. Su aplicación sobre el extracto de tallo de ananá mostró indicadores de desempeño adecuados en términos de rendimiento de BR (79,3%), pero no así en purificación (1,51). Sin embargo, para el procesamiento del látex se pudo recuperar el 72% de PAP y purificarla 2,41 veces, siendo esta performance sensiblemente mejor que aquella lograda en la extracción líquido-líquido con SBAs sin alginato. Como conclusión final, se puede afirmar que la metodología integradora propuesta resultó eficaz como primer paso extractivo para la recuperación de PAP a partir de látex de Carica papaya, no sólo por sus indicadores, sino por las ventajas de esta metodología en términos de simplicidad y sustentabilidad. En el caso de la extracción de BR a partir de tallo de ananá se halló más conveniente la extracción empleando SBAs PEG/NaCit sin alginato.