Estudio de la actividad biológica de cepas argentinas del Gammaherpesvirus bovino 4 (BoHV-4) filogenéticamente divergentes - Morán, Pedro Edgardo (2019)
El Gammaherpesvirus bovino 4 (BoHV-4) es un miembro del género Rhadinovirus, de la subfamilia Gammaherpesvirinae, dentro de la familia Herpesviridae. Al igual que los demás agentes virales de esta subfamilia, se caracteriza por su capacidad linfotrópica, pudiendo establecer latencia en linfocitos y monocitos, además de infecciones citolíticas en células epiteliales y o fibroblásticas. El BoHV-4 posee genes homólogos a los celulares, como el gen de la 2β-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa, con un 81.1% de similitud con la enzima producida por células de humano. Esta enzima tiene un rol crucial en la síntesis de glucanos. Asimismo, codifica una proteína esencial para el establecimiento de latencia, las proteínas v-Bcl2 y v-Flip (productos asociados a procesos de muerte celular), y la glucoproteína gp180 que tiene un rol importante en la provisión de un escudo de O-glucanos que enmascararía los epitopes en las glucoproteínas virales, contribuyendo a la evasión de los anticuerpos neutralizantes. En contraste con la mayoría de los gammaherpesvirus, el BoHV-4 presenta la capacidad de replicar en un amplio rango de especies domésticas y silvestres, así como en una gran variedad de cultivos celulares, incluyendo líneas celulares de humanos. Además, puede producir distintos tipos de síndromes, y si bien se lo asocia con enfermedad uterina posparto en bovinos, aún no se ha podido esclarecer el rol que desempeña en esta patología. El primer aislamiento del BoHV-4 fue realizado por Bartha en Hungría, en 1963; posteriormente fue aislado en Estados Unidos. Desde entonces, más de 40 cepas diferentes han sido aisladas en todo el mundo. A partir de estas cepas se establecieron tres grandes grupos basados en su análisis genómico: el tipo Movar 33/63, que comprende las cepas europeas; el tipo DN599, conformado por las cepas americanas, y un tercer grupo que incluye cepas de búfalo africano. La capacidad del BoHV-4 de presentar variaciones genómicas ha sido demostrada en estudios genéticos de cepas de referencia. Esta variabilidad sería el resultado de eventos de recombinación entre cepas y dentro de una misma cepa. En Argentina, el BoHV-4 fue aislado y caracterizado molecularmente por Verna et al. en el año 2007 a partir de muestras de vacas abortadas. El estudio de filogenia de las cepas locales aisladas demostró un importante grado de variabilidad genómica entre las cepas circulantes, revelando la existencia de tres grupos diferentes, designados como genotipos 1, 2 y 3. Las cepas de los genotipos 1 y 2 presentaron mayor similitud con los tipos europeo y americano, respectivamente; las del genotipo 3 constituyen un nuevo grupo filogenético. Actualmente hay más de 50 aislamientos de BoHV-4 en nuestro país; el 85 % de estos se obtuvieron de muestras de mucus cérvico-vaginal de vacas que presentaron abortos. Sobre la base de la información que aporta la bibliografía internacional y los antecedentes locales se puede inferir que existen amplias diferencias en las propiedades biológicas y en el potencial patogénico del BoHV-4. Las variadas manifestaciones clínicas asociadas a las infecciones por el BoHV-4 y la heterogeneidad en los patrones de restricción del genoma viral, sugieren que las variantes genómicas podrían asociarse a variaciones en la actividad biológica de este virus. Por lo mencionado precedentemente, considerando la importancia de la presencia del BoHV-4 en Argentina en función a su relación con pérdidas reproductivas y potencialidad de este virus para infectar células humanas, el objetivo de este trabajo de tesis fue realizar un estudio de cepas virales filogenéticamente diferentes, aisladas en nuestro país, a los efectos de conocer si la diferencias genéticas están asociadas a características biológicas particulares. Para cumplir con los objetivos propuestos se desarrollaron experimentos in vitro para estudiar la actividad biológica de seis cepas argentinas pertenecientes a los tres grupos genéticos mencionados, sobre líneas celulares de diferente origen. Se analizaron la cinética de replicación viral, la manifestación de efecto citopático, la capacidad lítica, la producción de placas de infección y la capacidad de infección de células de origen humano. Luego se estudiaron los efectos de las diferentes cepas sobre su capacidad de inducir apoptosis, para lo cual se procedió a identificar cambios nucleares compatibles con esta, detectar la fragmentación del ADN y detección y análisis de los genes v-Flip y v-Bcl2. Para complementar estos estudios se realizó un experimento in vivo, mediante la infección experimental de bovinos, con el objetivo de realizar un estudio descriptivo de la distribución tisular de las cepas locales del BoHV-4 genéticamente diferentes. El estudio de cinética de replicación se realizó con las seis cepas de BoHV-4 pertenecientes a los tres grupos genéticos en las líneas celulares de origen humano (HeLa y Hep2), la línea de origen bovino MDBK y la línea Vero de riñón de mono. La cepa (08/330), correspondiente al genotipo 2, alcanzó títulos de 5 a 9 logaritmos, significativamente más altos (p < 0.05) que el resto de las cepas. La cinética de replicación de las cinco cepas restante presentó mayor variabilidad en los cultivos de HeLa y Hep2 en comparación con las líneas celulares MDBK y Vero, con títulos que variaron de 2 a 4.5 logaritmos. La cepa 12/365 (genotipo 2), no manifestó actividad viral en la fracción extracelular a las 24 horas posinfección (hpi) en ninguno de los cultivos celulares, además esta cepa mostró mayor variabilidad en la cinética en las cuatro líneas celulares. Este ensayo permitió, además, comprobar que las líneas de origen humano y de mono son susceptibles y permisivas a la infección por estas cepas locales de BoHV-4. En los distintos ensayos, para confirmar la presencia del genoma viral se modificó y optimizó una nested PCR, descripta por Fábián y Egyed (2004), para amplificar un fragmento de 271 pares de bases (pb) del ORF25, el cual codifica la proteína mayor de la cápside. La mayoría de las cepas produjo efecto citopático entre las 24 y 48 hpi en células MDBK y Hep2. En las líneas celulares HeLa y Vero, la producción de efecto se evidenció más tardíamente (72 hpi). La presentación del efecto citopático fue variable entre las cepas y entre los cultivos celulares. En el ensayo de placa de lisis, se observó una amplia variabilidad en los tamaños de las placas, principalmente entre las líneas celulares. Las cepas 09/227, 08/263 y 07/435 produjeron placas de tamaño medio (1 a 3 mm) en células MDBK, el tamaño de estas placas fue significativamente mayor (p < 0.05) con respecto a las placas producidas por las cepas 08/330 y 12/365. Por el contrario, en las células HeLa, estas cepas produjeron placas significativamente mayores (p < 0.05) que las cuatro cepas restantes. En las células Hep2 y Vero, todas las cepas produjeron placas mínimas (< 1mm). No se produjeron placas grandes (> 3mm) en ninguno de los tipos de células. Como resultado de la inmunofluorescencia directa utilizada en el ensayo de placas de infección, se observó una marcada disparidad entre las distintas cepas para ser reconocidas por los anticuerpos disponibles. Posiblemente, el uso de reactivos elaborados con anticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos de cepas foráneas no resultan de utilidad para la identificación efectiva de aislamientos locales. En el estudio de los efectos de las cepas de BoHV-4 sobre la inducción de apoptosis se identificaron cambios nucleares indicativos de apoptosis mediante tinción con DAPI. El mayor número de células con cambios nucleares, representado como índice relativo de apoptosis (IRA) y la mayor variabilidad entre cepas se registraron en la línea celular MDBK. En los cultivos de células Hep2 y HeLa no se evidenciaron variaciones significativas (p > 0.05) entre las cepas, al igual que en la línea Vero, en la cual se registró el IRA más bajo. Para evaluar si las cepas de BoHV-4 analizadas inducen la fragmentación del ADN se utilizaron las técnicas de electroforesis en gel de agarosa y TUNEL sobre las líneas celulares MDBK y HeLa. Solamente en las células HeLa se observó fragmentación del ADN, a las 24 hpi, en las células inoculadas con las cepas 09/508 y 08/330. Utilizando la técnica de TUNEL, los IRAs más elevados se registraron, en las células MDBK a las 24 hpi, aunque sin detectarse diferencias entre el control positivo y las seis cepas de BoHV-4 (p > 0.05). A las 48 hpi solamente las cepas 08/263 y 09/227 mostraron IRAs significativamente más elevados (p < 0.05) que ambos controles. En las células HeLa, sólo la cepa 12/365 evidenció un IRA significativamente mayor (p < 0.05) que los controles a las 48 hpi. También se analizaron los genes v-Flip y v-Bcl2 en los seis aislamientos. En las cepas 08/263 y 08/330, correspondientes al genotipo 2, no fue posible amplificar la secuencia de ninguno de estos genes. Las variaciones halladas en las cuatro cepas restantes, ocasionadas por sustituciones nucleotídicas en ambos genes, se tradujeron en cambios en las respectivas proteínas y en mayor grado en la proteína v-Flip, por lo que se podría inferir que la actividad de esta proteína presentaría variaciones dependiendo de la cepa. Si bien sólo se utilizaron cuatro cultivos celulares de distinto origen, la evaluación general de los resultados revela que las cepas de BoHV-4 analizadas no inducen elevados niveles de apoptosis. Por último, se realizó un estudio in vivo en un modelo bovino para analizar la distribución tisular, presencia, tipo y severidad de lesiones y respuesta inmune humoral. Se seleccionaron tres cepas de BoHV-4 de diferente genotipo. Se utilizaron 4 terneros de 6 meses de edad, inoculados por vía intranasal mediante aerosolización, de la siguiente manera: ternero 1 (T1) cepa 09/508 (genotipo 1), ternero 2 (T2) cepa 08/330 (genotipo 2), ternero 3 (T3) cepa 07/435 (genotipo 3) y ternero 4 (T4) control inoculado con medio de cultivo como placebo. Se extrajeron muestras de secreciones nasales, oculares y sangre con y sin anticoagulante a los 0, 7, 14 y 21 días posinfección (dpi) para la detección de genoma viral, aislamiento viral y para la búsqueda y determinación de los títulos de anticuerpos neutralizantes. La eutanasia de los animales se realizó a los 21 dpi y se extrajeron muestras de diferentes tejidos para aislamiento viral, detección de genoma viral e histopatología. No se observaron signos clínicos en ninguno de los animales. El ADN viral se detectó en leucocitos de sangre periférica (LSP) del T1 a los 21 dpi y del T2 a los 14 y 21 dpi. En las muestras de tejidos, se detectó el genoma viral en bazo, médula, ganglio trigeminal, tráquea y lóbulo piriforme del T1 (cepa 09/508); bazo, tráquea, riñón, linfonódulo retrofaríngeo y lóbulo frontal del T2 (cepa 08/330), y linfonódulo pulmonar, lóbulos frontal y piriforme del T3 (cepa 07/435). Las muestras de secreciones, tejidos y LSP del ternero control (T4) resultaron negativas. La cepa 08/330 se aisló en las secreciones oculares y nasales del T2 a los 7 dpi y la cepa 07/435 de secreciones nasales del T3. A los 14 dpi se aislaron las cepas 09/508 (genotipo 1), 08/330 (genotipo 2) y 07/435 (genotipo 3) en las secreciones nasales de T1, T2 y T3, respectivamente. Todos los aislamientos se identificaron por nested PCR. Ninguna de las cepas se aisló de los tejidos y LSP de los tres animales inoculados, y las muestras del ternero control también resultaron negativas. Durante la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas en ninguno de los animales. Microscópicamente se observó una leve respuesta inflamatoria con infiltrado mononuclear en tejidos respiratorios y linfáticos del T1 (cepa 09/508) y T3 (cepa 07/435). En el tejido nervioso de estos animales se observó gliosis leve, neuronas colapsadas con núcleos picnóticos, citoplasma eosinofílico y cromatolisis, hipercromatosis neuronal y satelitosis leve. No se hallaron lesiones histológicas en las muestras de T2 (cepa 08/330) y T4 (control). En los sueros de los cuatro animales se observó actividad neutralizante para la cepa 08/330, al igual que para la cepa 07/435 en los T1, T2 y T3. Solamente se detectó seroconversión en T1, a los 21 dpi, cuando los sueros se enfrentaron con la cepa homóloga (09/508). Cuando se analizaron los sueros con las tres cepas no utilizadas en el ensayo in vivo (08/263, 12/365 [genotipo 2] y 09/227 [genotipo 3]) sólo se evidenció efecto neutralizante para la cepa 08/263 en T1, T3 y T4, en bajos títulos. Los hallazgos de este estudio sugieren que, aunque leves, hay diferencias en la actividad biológica de las cepas utilizadas en este trabajo, además de comprobarse que estos aislamientos locales de BoHV-4 pueden infectar células de origen humano. No obstante, a pesar de las diferencias observadas en la actividad de estas cepas de BoHV-4 in vitro, no fue posible establecer una asociación entre los grupos filogenéticos y los patrones de comportamiento biológico de cada cepa en los experimentos in vitro y en el modelo experimental in vivo.