Caracterización fenotípica y genotípica de cepas de Campylobacter fetus aisladas de rodeos bovinos - Chiapparrone, María Laura (2018)
Campylobacter fetus subsp. venerealis y Campylobacter fetus subsp. fetus son agentes causales de la campylobacteriosis genital bovina (CGB), una de las enfermedades reproductivas más importantes en los rodeos bovinos de Argentina. Hasta la actualidad, se han realizado escasos estudios sobre el comportamiento de ambas subespecies de C. fetus en los rodeos bovinos. Lo antedicho, probablemente se deba a que el diagnóstico de rutina de la CGB se realiza por inmunofluorescencia directa (IFD) a partir de muestras de esmegma prepucial por su rapidez, bajo costo, sensibilidad y especificidad, pero sin la identificación microbiológica de las cepas. Además, los conjugados que se emplean en esta técnica, no diferencian entre C. fetus subsp. fetus y C. fetus subsp. venerealis. Por lo tanto, se carece de información sobre la presencia de ambas subespecies a nivel regional. El cultivo microbiológico sigue siendo la técnica de referencia, sin embargo la alta contaminación de algunas muestras clínicas, sumado al costo de un equipamiento adecuado y el tiempo que requiere el cultivo y la posterior caracterización por pruebas bioquímicas, determinan que el diagnóstico microbiológico no se realice en forma rutinaria. En las últimas décadas se han desarrollado y puesto a punto técnicas de biología molecular para optimizar la identificación y la caracterización de C. fetus. La aplicación de nuevas técnicas permitirá complementar los resultados obtenidos por las pruebas tradicionales, caracterizar los perfiles fenotípicos y genotípicos de las cepas, determinar su influencia en la patogenia de la enfermedad, el grado de homología entre ellas y finalmente, contribuir con estudios epidemiológicos que analicen el comportamiento de las cepas en los rodeos a través de los años. El objetivo de la presente tesis doctoral fue caracterizar parámetros fenotípicos y genotípicos de cepas de C. fetus aisladas del tracto reproductor y de abortos bovinos de la provincia de Buenos Aires. El documento se divide en cuatro capítulos, correspondiendo cada uno de los objetivos particulares propuestos. En el Capítulo I se realiza la identificación de las cepas de C. fetus del cepario constituido a partir de los ceparios de C. fetus pertenecientes a los laboratorios de Bacteriología (EEA-INTA Balcarce) y Microbiología Clínica y Experimental de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA) conformados por primoaislamientos de muestras de esmegma prepucial, mucus cérvico vaginal y abortos, conservados a -80 °C. La identificación de C. fetus se realizó mediante IFD y pruebas bioquímicas convencionales. De un total de 159 aislamientos registrados en ambas instituciones entre los años 1999 y 2014, se seleccionaron 95 cepas indígenas de C. fetus de los ceparios citados. Los criterios de selección considerados fueron: año de aislamiento, muestras clínicas de origen y localización geográfica, los cuales permitieron los estudios de distribución temporal y espacial que se desarrollaron en los capítulos siguientes. Para la identificación bioquímica de género, especie y subespecie bacteriana, las cepas fueron descongeladas y cultivadas. Posteriormente, se realizó la descripción de la morfología de colonias y bacteriana mediante tinciones y observación en fresco por microscopía de campo oscuro. La inmunomarcación de las cepas se realizó por IFD. La identificación de especie y subespecie bacteriana se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina de nuestro laboratorio. Conjuntamente, se utilizó un sistema comercial miniaturizado de identificación para bacterias del género Campylobacter, Arcobacter y Helicobacter de origen humano. La morfología de las colonias y bacteriana de todas las cepas, fueron compatibles con las descriptas para las especies de Campylobacter. La IFD y las pruebas bioquímicas de rutina permitieron clasificar todas las cepas dentro de la especie C. fetus. Por pruebas bioquímicas, se diferenciaron ambas subespecies. La totalidad de las cepas analizapositiva. Las pruebas de producción de SH2 en sustratos sensibilizados y de tolerancia a la glicina, fueron definitorias en la determinación de la subespecie bacteriana y para el biotipo intermedius de C. fetus subsp. venerealis. Por pruebas bioquímicas convencionales, 50 cepas (52,6%) fueron clasificadas como C. fetus subsp. fetus, 40 (42,1%) como C. fetus subsp. venerealis y 5 (5,3%) como C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius. El sistema miniaturizado comercial no permitió la diferenciación de algunas cepas de ambas subespecies: seis cepas (6,3%) no pudieron ser caracterizadas. Sesenta y ocho (76,4%) fueron identificadas como C. fetus subsp. venerealis y 21 (23,6%) clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus. Los resultados de la identificación de especie y subespecie bacteriana por pruebas bioquímicas y el sistema comercial, fueron comparables para 89 cepas. Se registraron coincidencias para 32 cepas identificadas como C. fetus subsp. venerealis por ambas metodologías. De las 21 cepas clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus por el sistema comercial, 15 se correspondieron con C. fetus subsp. fetus y seis con C. fetus subsp. venerealis por pruebas bioquímicas. La limitante del sistema comercial para identificar cepas de C. fetus subsp. fetus, no permitió comparar los resultados para esta subespecie.das presentaron fluorescencia En el Capítulo II, se caracterizan los parámetros de patogenicidad de C. fetus mediante la capacidad de adherencia y citopatogenicidad. Como modelos de estudio se utilizaron cultivos celulares primarios de útero y vagina bovina y la línea celular MDBK. Las monocapas con semiconfluencia celular, fueron desafiadas con las cepas. Para los cultivos primarios se seleccionaron 35 cepas (13 cepas de C. fetus subsp. venerealis, dos de C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius y 20 de C. fetus subsp. fetus) en base a: el año de aislamiento, la muestra clínica de origen, la localidad geográfica y la subespecie bacteriana. Los cultivos de células MDBK fueron desafiados con la totalidad de las cepas. El inóculo fue establecido en una DO610 de 0,8. La incubación se realizó de acuerdo al objetivo del ensayo: evaluación de la capacidad de adherencia (3 h) y efecto citopatogénico (48-72 h). La adherencia bacteriana se observó por tinción de Giemsa y fueron puestas a punto las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido para confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Se calcularon los indicadores: porcentaje de adherencia a células y número de bacterias adheridas por célula. Para la comparación de los cultivos primarios y células MDBK, las cepas fueron utilizadas como bloques para las variables observadas. El efecto de los cultivos se evaluó mediante un análisis de variancia (ANOVA) con un diseño en bloques. Los resultados permitieron confirmar la capacidad de adherencia de C. fetus a las células uterinas, vaginales y MDBK como así también la aplicabilidad de las técnicas empleadas. El 100% de las cepas fueron adherentes. Los porcentajes de adherencia fueron significativamente mayores para los cultivos primarios en relación a la línea MDBK. Contrariamente, el número de C. fetus por célula fue significativamente mayor para las células MDBK. La aplicación de las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido permitieron confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Para la evaluación del efecto citopatogénico de C. fetus en células uterinas, vaginales bovinas y MDBK, se registraron alteraciones citoplasmáticas, nucleares y muerte celular. Las alteraciones citoplasmáticas fueron evaluadas mediante la observación en fresco y tinción de Giemsa. El coeficiente de distensión celular ((F<1,3) en células desafiadas y controles, se determinó con la aplicación del programa Image Pro. La actividad mitótica y las alteraciones nucleares mediante tinción DAPI. La observación de los cultivos celulares en fresco y por tinción de Giemsa, permitió establecer una secuencia de hallazgos: granulación del citoplasma, vacuolización citoplasmática, redondeamiento y distensión celular, condensación nuclear y muerte celular con desprendimiento de la monocapa. Las alteraciones se observaron en el 100% de las cepas analizadas para ambos cultivos. La distensión celular fue significativamente mayor en cultivos primarios y la citopatogenicidad en células uterinas. La evaluación de la actividad mitótica en los cultivos de células MDBK, permitió identificar los distintos estadios del ciclo celular, con detenimiento en interfase y profase en los cultivos desafiados respecto a los controles. En los núcleos de células MDBK desafiadas con 17 cepas, se registraron modificaciones compatibles con efectos apoptóticos. El desarrollo y la implementación de los modelos de estudio in vitro permitieron profundizar los conocimientos referentes a la adherencia y el efecto citopatogénico de C. fetus, considerando la importancia de los aspectos éticos, económicos, de bienestar animal y de practicidad. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros de patogenicidad de C. fetus en los cultivos celulares, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman, utilizando el procedimiento PROC CORR del SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Se consideraron como relevantes aquellas correlaciones ≥ 0,5. El análisis de las correlaciones de los parámetros de patogenicidad evaluados en cultivos primarios y células MDBK, permitió obtener resultados similares por ambos métodos. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas, significativas y de distinta magnitud. La mayor correlación en los tres cultivos se registró entre el porcentaje de adherencia y de citopatogenicidad. En el Capítulo III se caracterizaron los perfiles moleculares de C. fetus. La caracterización de los perfiles proteicos de las cepas se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Los extractos bacterianos de las 95 cepas fueron obtenidos según la metodología de Laemmli (1970). Las corridas se realizaron en un sistema homogéneo en gel de poliacrilamida al 10% (Brooks et al., 1996). Los perfiles moleculares proteicos fueron visualizados por coloración con Coomassie Blue. El análisis proteico se basó en la detección del polipéptido mayor que se correspondería con la microcápsula. Ochenta y siete (91,6%) cepas de C. fetus presentaron bandas del polipéptido mayor con variabilidad de pesos moleculares que se ubicaron en un rango de 100 a 117 kDa. La variabilidad para las cepas de casos intrarodeo fue menor. La tipificación genotípica de las cepas de C. fetus, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La puesta a punto, se realizó teniendo en cuenta el protocolo descripto por Schulze et al. (2006) basado en el trabajo de Hum et al. (1997) modificando las condiciones de reacción y termociclado (Henegariu et al., 1997). Se emplearon los primers MG3F - MG4R para la detección de la especie C. fetus y los primers VenSF - VenSR para la diferenciación de la subespecie de C. fetus subsp. venerealis (Hum et al., 1997). A partir de los cultivos puros de las cepas en estudio, se realizaron suspensiones bacterianas con una DO610 0,1. La extracción de ADN se realizó por ebullición. Como controles negativos se utilizaron cepas de C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis, C. bubulus y E. coli. La PCR permitió tipificar la totalidad de las cepas en estudio, dentro de la especie C. fetus y diferenciar ambas subespecies: C. fetus subsp. venerealis 49 (51,6%) y C. fetus subsp. fetus 46 (48,4%). Las cepas de casos intrarodeo fueron tipificadas dentro de la misma subespecie. No se observaron amplificaciones inespecíficas ni resultados positivos para microorganismos estrechamente relacionados. La caracterización y subtipificación de las cepas de C. fetus, se realizó por análisis de polimorfismos genéticos a partir de la aplicación de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE - SmaI). Para la implementación de la técnica, se seleccionaron 28 cepas en base a los parámetros descriptos anteriormente. Se aplicó el protocolo para la subtipificación molecular de C. jejuni elaborado por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades (CDC) en el marco de la Red PulseNet América Latina y el Caribe para la subtipificación de Campylobacter spp. La interpretación de los resultados se realizó de acuerdo a lo descripto por Tenover et al. (1995). La observación y el registro fotográfico de los geles se realizaron en el fotodocumentador BioRad Gel DOC EQ System y software Quantity One. La comparación de los perfiles de PFGE (PFPs) se realizó visualmente. Para la interpretación de los datos y la elaboración de los dendogramas, se utilizó el programa informático Bionumerics v.5.1 (Applied Maths). Con el objetivo de determinar la relación genética entre las cepas de C. fetus seleccionadas en esta tesis y cepas de C. fetus, C. coli y C. jejuni, se seleccionaron aislamientos pertenecientes a la Red PulseNet. Los perfiles de PFGE obtenidos para C. fetus presentaron fragmentos incluidos en un amplio rango de tamaño y con una distribución homogénea. La homología interespecie entre C. fetus, C. coli y C. jejuni fue 40 - 50% e intraespecie para C. fetus > 70%. La PFGE – SmaI permitió identificar 19 PFPs para las 28 cepas de C. fetus. En el Capítulo IV se relacionaron los parámetros fenotípicos y genotípicos analizados en los capítulos anteriores, con los datos de origen de las cepas de C. fetus y entre sí. La distribución temporal y por muestra clínica de origen de las subespecies de C. fetus fueron analizadas mediante las herramientas de gráfico en el programa Excel. La distribución espacial se evaluó mediante el programa SatScan V9.3 tomando como unidad de localización geográfica al centroide del partido de origen de las cepas. La visualización espacial de las cepas se realizó mediante mapas gráficos utilizando el software QGis 2.10.1. Para la visualización de la distribución espacial de los parámetros de patogenicidad se consideraron los mayores y menores porcentajes de adherencia y de citopatogenicidad para cada subespecie bacteriana. El efecto del origen y de la subespecie de C. fetus sobre los parámetros de patogenicidad, se analizó mediante un ANOVA. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros observados en los distintos cultivos celulares en relación a la muestra clínica de origen y las subespecies, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman. En el período de tiempo analizado se registró la presencia de ambas subespecies de C. fetus con un predominio de C. fetus subsp. fetus en siete años. El mayor número de cepas de C. fetus subsp. fetus fueron aisladas de fetos y de C. fetus subsp. venerealis de hembras y toros. Se observa una distribución temporal homogénea para el porcentaje de adherencia de las cepas en los diferentes cultivos. En células MDBK, los porcentajes fueron menores en relación a los cultivos primarios. La distribución del número de C. fetus por célula fue homogénea, si bien en la mayoría de los años los mayores valores se registraron en los cultivos de células MDBK. Los porcentajes de citopatogenicidad de las cepas fueron superiores al 50% y el F > 1,3 en todos los años de estudio. La subespecie bacteriana no tuvo efecto significativo sobre los parámetros de patogenicidad evaluados. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas y significativas. La adherencia y el efecto citopatogénico se correlacionaron independientemente del número de bacterias adheridas por célula, principalmente para las cepas aisladas de fetos y hembras. La presencia del polipéptido mayor fue independiente de los datos de origen de las cepas. La distribución temporal de las cepas con el polipéptido mayor fue homogénea en todos los años. Al evaluar la distribución espacial, no se observó ninguna tendencia de distribución definida. El polipéptido se observó en 46 cepas aisladas de fetos, 30 de hembras y 11 de toros. En cambio, las cepas que no presentaron el polipéptido fueron aisladas de muestras de fetos (3) y hembras (5). La subespecie bacteriana no tuvo asociación significativa sobre los parámetros de patogenicidad. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las subespecies bacterianas, los parámetros de patogenicidad y la presencia del polipéptido mayor de las cepas no registraron tendencias de distribución temporal ni geográfica. Los resultados de la distribución temporal, espacial y por muestra clínica de origen para las cepas caracterizadas por PCR, fueron similares a los obtenidos por pruebas bioquímicas. Los PFPs de C. fetus no se relacionaron con el año de aislamiento, la localización geográfica y la muestra clínica de origen de las cepas en estudio. El porcentaje de similitud para la especie C. fetus fue > 70%. El porcentaje intrasubespecie para C. fetus subsp. venerealis (13 cepas) fue > 80% y sólo tres fueron 100% homólogas y para C. fetus subsp. fetus (15 cepas) > 70%, ocho fueron indistinguibles bajo esta metodología. Los resultados confirman la utilidad de la PFGE – SmaI como una herramienta molecular de alto poder discriminatorio a nivel de subespecie para C. fetus. Para C. fetus subsp. venerealis, sólo dos cepas aisladas de mucus cérvico vaginal fueron indiferenciables bajo esta metodología. En las cepas aisladas de toros las homologías registradas fueron < 75% y para los fetos < 70%. Para C. fetus subsp. fetus, tres cepas aisladas de feto fueron indistinguibles. En las cepas aisladas de hembras las homologías fueron < 70% y en toros <75%. Los PFPs registrados para ambas subespecies en los casos intrarodeo se correspondieron tanto con cepas homólogas como heterólogas. Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por pruebas bioquímicas y la PCR para caracterizar las subespecies, se realizó el test de Mc Nemar y se estimó el coeficiente Kappa mediante el procedimiento PROC FREQ del SAS V.9.12 (SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA). Para la subespecie C. fetus subsp. venerealis, fueron identificadas por pruebas bioquímicas 45 cepas (47,4%) y por PCR 49 (51,6%). Para C. fetus subsp. fetus por pruebas bioquímicas 50 cepas (52,6%) y por PCR 46 (48,4%). El test de Mc Nemar no detectó diferencias significativas (p=0,1573) y el coeficiente Kappa fue de 0,8319 indicando una alta concordancia entre ambas técnicas. El bajo número de cepas procesadas por PFGE limitó la asociación de los PFPs con la presencia del polipéptido mayor. Los parámetros fenotípicos y genotípicos considerados en la presente tesis, no se relacionaron entre sí. Finalmente, se concluye que las cepas de C. fetus actuantes en los rodeos bovinos poseen diferencias fenotípicas y genotípicas.