Estudio de fagos codificantes de toxina Shiga subtipo 2a presentes en aislamientos nativos de Escherichia coli

• Autores: Burgán, Julia
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Lucchesi, Paula M.A.; Krüger, Alejandra
• Materia: Medicina veterinaria; Escherichia coli; Síndrome urémico hemolítico; SUH; Bovinos; Toxina Shiga; Tesis de doctorado
• Institución: Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, el síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es una afección severa que afecta con mayor frecuencia a niños menores de 5 años. En niños y adolescentes representa una de las principales causas de insuficiencia renal aguda y crónica, y es el responsable de una importante proporción de los trasplantes de riñón. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento específico y, en los casos más graves, puede derivar en la muerte del paciente. Argentina presenta la mayor incidencia de SUH a nivel mundial. El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de alimentos derivados contaminados, como la principal vía de transmisión a humanos. El contacto directo con animales portadores, y su entorno, y el contacto persona a persona son otras fuentes importantes de contagio. Varios factores de virulencia han sido descriptos para estas bacterias, pero no se conocen cuáles son las características que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad común a todas y que juega un papel esencial en el desarrollo de SUH, es la producción de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades. El subtipo Stx2a es el mayormente asociado a SUH. Dentro del genoma bacteriano, los genes stx se encuentran codificados en bacteriófagos temperados, denominados fagos Stx. Estos fagos, que muestran una gran diversidad, desempeñan un rol fundamental en la patogénesis de STEC: influyen en la expresión de stx, y durante la lisis bacteriana, producto de la inducción de los profagos, se produce la liberación de estas toxinas. Estos fagos también desarrollan un importante papel en la propagación y transferencia de genes de virulencia y, como consecuencia, en la formación de cepas patógenas emergentes. Se han identificado más de 400 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a enfermedad en humanos. En la mayoría de las infecciones el serotipo involucrado es O157:H7. Sin embargo, en la actualidad existen a nivel mundial muchos casos de enfermedad causados por cepas de otros serotipos. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. Para ello se propuso resubtipificar las cepas, caracterizar regiones involucradas en la regulación del ciclo lítico de los fagos, cuantificar los niveles de expresión y de inducción de profagos Stx2a y comparar los resultados obtenidos de acuerdo a distintas particularidades de los fagos y de las cepas portadoras. También se evaluó el comportamiento de un mismo fago en diferentes entornos bacterianos. En cuanto a la resubtipificación, todas las cepas previamente caracterizadas como portadoras del subtipo vt2EDL933 fueron positivas para stx2a. Las cepas que además portaban el/los subtipo/s vt2vha y/o vt2vhb se resubtipificaron como positivas para stx2c y las cepas que presentaban el subtipo vt1EDL933, fueron positivas para stx1a. En la mayoría de las cepas se confirmó la proximidad del gen ninG a stx2 y la presencia del alelo q933, solo o en combinación con el alelo q21. De las cepas negativas para ninG, una fue positiva para el alelo qO111 y el resto negativas para los 3 alelos de q estudiados. En general, las cepas que presentaron el alelo q933 portaban el subtipo stx2a y las positivas para los alelos q933 y q21, portaban stx2a y stx2c. Si bien esta asociación entre subtipos de stx y alelos de q ya ha sido observada en otros trabajos, no es una asociación exclusiva. En cuanto al alelo qO111, se encontró en una cepa genotipo stx1a/stx2a. Los niveles de expresión de stx2a detectados entre las cepas fueron heterogéneos, tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros grupos de trabajo. Sólo en una de las cepas O145:H- de origen humano no se detectó expresión en ninguna de las condiciones. En la mayoría de las cepas tratadas con mitomicina C la expresión de stx2a fue mayor respecto a la expresión basal, con la excepción de una cepa O91:H21 y la O113:H21, ambas aisladas de alimentos, que mostraron una expresión similar en ambas condiciones. Mediante el método de la capa doble de agar se detectó producción de partículas infectivas de fagos en la mayoría de las cepas analizadas. Los títulos de fagos con mitomicina C aumentaron en un rango de entre 1 y 3 órdenes de magnitud con respecto a los títulos fagos inducidos de manera espontánea Algunos fagos produjeron placas de lisis turbias, difíciles de ver y poco definidas. En una cepa O26:H11 y en dos O157:H7, se evidenciaron por hibridación placas de lisis no detectadas visualmente. Por qPCR, los niveles de inducción de fagos Stx2a fueron variables y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros investigadores. El aumento en la producción de fagos Stx2a con mitomicina C también se evidenció en la mayoría de las cepas, en un rango de 1 a 2,5 logs. Las excepciones fueron una cepa O91:H21 de bovino, que produjo similares cantidades fagos en ambos estados, y dos cepas que no produjeron partículas detectables de fagos Stx2a: otra cepa O91:H21 y la O145:H- que tampoco presentó expresión de stx2a. En cuanto a la comparación de los resultados teniendo en cuenta diferentes variables, se observaron: a) mayor expresión basal de stx2a en las cepas O157:H7 que en las O26:H11, pero en respuesta a mitomicina C, mayor incremento en las cepas O26:H11 que en las O145:H- y O157:H7; b) mayor incremento de la expresión de stx2a con mitomicina C en las cepas aisladas de bovino que en las aisladas de humanos; c) niveles basales de expresión de stx2a inferiores en las cepas positivas para q933 que en las positivas para q933 y q21, y en las cepas ninG negativas con respecto a las ninG positivas; d) un mayor aumento en la producción de fagos con mitomicina C en las cepas que portaban sólo el subtipo stx2a con respecto a las que portaban tanto stx2a como stx2c. Por otra parte, se observó una correlación positiva moderada entre los niveles de expresión basales e inducidos. Dado que en la bibliografía no se ha observado una única tendencia en la asociación entre los niveles de expresión de stx2a y de producción de fagos con las distintas características de las cepas, los resultados obtenidos son, en algunos casos, similares a los reportados por otros investigadores. Tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, en los lisógenos generados se detectó expresión de stx2a, placas de lisis y producción de Stx. Comparado con los resultados obtenidos en cada ensayo con la cepa wild type correspondiente, los niveles de expresión estuvieron dentro del mismo orden, la producción de fagos de los lisógenos fue mayor y la cantidad de Stx presente en sus sobrenadantes fue igual o ligeramente menor. En resumen, se encontró que la mayoría de las cepas, independientemente del serotipo y el origen, portaron fagos Stx2a inducibles, mostraron expresión basal de stx2a y aumento en la expresión e inducción de profagos por efecto del agregado de mitomicina C. Además, los lisógenos obtenidos se comportaron de manera similar a las cepas wild type. Estos resultados sugieren que los fagos estudiados aportan características asociadas a una alta virulencia a las cepas que los portan, las cuales, en consecuencia y sin importar su serotipo, representan un potencial riesgo para la salud humana. Las características observadas de los fagos Stx2a presentes en las cepas circulantes en nuestra región, aisladas tanto de bovinos como de humanos, podrían contribuir a la alta incidencia de enfermedad observada.
Fil: Burgán, Julia. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Lucchesi, Paula M.A. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Krüger, Alejandra. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a pathogenic microorganism that can colonize the gastrointestinal tract of animals, causing diarrhea and severe diseases such as hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. HUS is a severe condition that mainly affects children under 5 years old. In children and teenagers it is the most important cause of acute and chronic renal failure, and is responsible for a significant percent of kidney transplants. There is no specific therapy for this disease and in some cases it can lead to death. Argentina has the highest incidence of HUS worldwide. Cattle are the main reservoir of STEC, and bovine-derived products are the main source of infection. Contact with animals carrying STEC, and their environment and person-to-person contact are other important modes of transmission. Several virulence factors have been described for these bacteria, but the characteristics that certainly define a STEC strain able to produce severe disease are not known. The pathogenicity mechanism common to all STEC, which is directly related with the development of HUS, is Shiga toxin (Stx) production. Several subtypes of Stx have been described and associated with different risks of disease development. Stx2a is subtype the most frequently associated with HUS. The stx genes are generally carried by phages whose genomes are integrated into the bacterial chromosome. These phages, called Stx phages, play an important role in the pathogenesis of STEC not only because stx expression is under the control of phage promoters, but also because of toxins release takes place during bacterial lysis caused by phage. These phages also play an important role in the spread of stx genes among bacteria and, as a consequence, in the generation of emerging pathogenic strains. More than 400 STEC serotypes have been identified and around 100 have been associated with disease in humans. In most infections the serotype involved is O157:H7. However, there are currently many cases of disease caused by strains of other serotypes worldwide. The general objective of this thesis was to characterize Stx2a phages present in STEC strains of different serotypes isolated from Argentina. For this, it was proposed to re-subtype the strains, to characterize regions involved in the regulation of the lytic cycle of phages, to quantify stx2a expression and phage production levels and to compare the results obtained according to different characteristics of phages and STEC strains. The behavior of one phage in different bacterial environments was also evaluated. Regarding the re-subtyping, all the strains previously characterized as subtype vt2EDL933, were positive for stx2a. The strains that also carried the subtype vt2vha and/or vt2vhb were re-subtyped as positive for stx2c and the strains that presented the subtype vt1EDL933, were positive for stx1a. In most of the strains the proximity of the ninG gene to stx2 and the presence of the q933 allele were confirmed, alone or in combination with the q21 allele. Between the ninG-negative strains, one was positive for the qO111 allele and the others were negative for the 3 q alleles studied. In general, the strains that presented the q933 allele carried the subtype stx2a and those positive for both q933 and q21, carried stx2a and stx2c. Although this association between subtypes of stx and q alleles has already been observed in other works, it is not an exclusive association. Regarding qO111 allele, it was found in a strain harboring stx1a/stx2a genotype. Heterogeneous levels of stx2a expression were detected among the strains, both in induced and non-induced conditions, and were in the orders of magnitude reported by other researchers. Only one O145:H- strain from human origin did not show detectable stx2a expression in either condition. Most strains increased stx2a expression under mitomycin C treatment, with the exception of 2 strains isolated from food, one O91:H21 and one O113:H21, that showed a similar expression both in inducing and non-inducing conditions. The presence of phage particles in culture supernatants was detected by the double-agar-layer method either by visual inspection or hybridization in most of the strains. The phage titers increased in the range of 1 to 3 logs under mitomycin C treatment. Some phages produced turbid lysis plaques, difficult to see and poorly defined. In one strain serotype O26:H11/O26:H11 and in 2 O157:H7 strains, lysis plaques had not been visually detected, but were evidenced by hybridization. For qPCR, Stx2a phage induction/production levels were variable and were in the orders of magnitude reported by other researchers. The increase of Stx2a phage production with mitomycin C was also evident in most of the strains, in a range of 1 to 2.5 logs. The exceptions were the O91:H21 cattle strain in which the amount of Stx2a phage particles was practically the same in both states, and two strains that did not produce qPCR-detectable Stx2a phage particles: another O91:H21, and the O145:H- strain, that had not showed detectable stx2a expression in either condition. Taking into account the different variables, statistical comparisons revealed: a) basal stx2a expression higher in O157:H7 strains than in O26:H11, however, the response to mitomycin C was higher in O26:H11 strains than in O145:H- and O157:H7 strains; b) a higher response to induction in strains from cattle than in those from humans; c) basal stx2a expression lower in q933-positive and ninG-negative strains than q933/q21- and ninG-positive strains, respectively; d) strains that carried only the subtype stx2a had an increase in the production of phages with mitomycin C than those that carried both stx2a and stx2c. Furthermore, Pearson’s coefficient between basal and mitomycin C induced stx2a expression levels indicated a moderate positive correlation. Due that in the literature it has not been observed a single trend in the association between the levels of stx2a expression and phage production according the different characteristics of the strains, the results obtained are, in some cases, similar to those reported by others researchers. Both in basal and with mitomycin C induced conditions, laboratory lysogens expressed stx2a and produced lysis plaques and Stx. Comparing the results obtained in each test with its corresponding wild type strain, the expression levels were in the same order, the phage production of the lysogens was higher and the amount of Stx present in their supernatants was equal or slightly lower. In conclusion, it was found that most of the strains, regardless serotype and origin, carried inducible Stx2a phages, showed basal stx2a expression and increased it expression and phage production due to the effect of mitomycin C treatment. In addition, the lysogens obtained behaved similarly to the wild type strains. These results suggest that the phages studied can contribute to characteristics associated with a high virulence of the strains that carry them, which, consequently and regardless of their serotype, represent a potential risk to human health. The features observed in these Stx2a phages carried by native strains, isolated from both cattle and humans, could contribute to the highest incidence of disease in our region.