Evaluación del potencial de una cepa nativa de Nannochloropsis oceanica CCALA 978 (Eustigmatophyta) como fuente de materia prima para la producción de biodiesel - Bongiovani, Natalia Soledad (2015)
La producción de biodiesel ha crecido durante los últimos años a nivel mundial, en respuesta al paulatino agotamiento de los recursos fósiles y a los efectos ambientales causados por el uso de los combustibles convencionales. Este biocombustible se obtiene a nivel industrial casi en su totalidad a partir de aceites de semillas. Sin embargo, la gran demanda energética, el agotamiento de los suelos y la utilización de semillas para fines alimenticios plantean la necesidad de nuevas fuentes de materia prima alternativa y sustentable. Muchas especies de microalgas, comúnmente denominadas oleaginosas, pueden almacenar altos contenidos de aceites, lo cual las convierte en una fuente potencial para la producción de este biocombustible. Algunas especies del género Nannochloropsis han sido propuestas para tal fin debido a su capacidad de acumular altos contenidos de lípidos, particularmente lípidos neutros, los cuales son la materia prima ideal para la producción de biodiesel. En Argentina, a diferencia de otras energías renovables, las investigaciones en este campo se encuentran en una etapa incipiente. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo general de esta Tesis fue evaluar el potencial de una cepa marina nativa de Nannochloropsis, aislada de la costa atlántica sur, como materia prima para la producción de biodiesel. Particularmente, los objetivos específicos fueron: la identificación a nivel de especie de la cepa en estudio a través de su caracterización morfológica y molecular; la optimización de técnicas para la determinación de la densidad celular, la concentración de pigmentos fotosintéticos y el contenido de lípidos neutros en cultivos a escala de laboratorio; el análisis del efecto de distintas condiciones ambientales (temperatura [15ºC y 25ºC], intensidad de luz [100 y 300 μmol fotón m-2 s-1] y fotoperiodo [12:12 h y 16:8 h de luz y oscuridad) y de la carencia de nitrógeno sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa y cantidad, productividad y calidad lipídica, con especial énfasis sobre la fracción de los lípidos neutros. Además, se evaluó el crecimiento de la cepa en estudio en un fotobiorreactor columnar de 25L y con un medio de cultivo (SWES) de menor costo que el empleado en experiencias de laboratorio (f/2). Los estudios morfológicos y ultraestructurales con microscopios óptico y electrónico y el análisis de los genes nuclear y cloroplástico, 18s rADN y rbcL respectivamente, permitieron identificar a la cepa en estudio como Nannochloropsis oceanica. La cepa fue depositada en el cepario Culture Collection of Autotrophic Organism (CCALA), República Checa, bajo la denominación Nannochloropsis oceanica CCALA 978. Se elaboró un modelo estimador de la densidad celular a través de lecturas de densidad óptica, el cual permite monitorear el crecimiento de N. oceanica CCALA 978 en forma rápida. Con respecto a la optimización de métodos para la determinación de pigmentos, el metanol asistido con congelado y descongelado rápido fue el método más efectivo para la extracción de clorofila a y carotenoides totales. El pre-tratamiento de las células con dimetilsulfóxido 5% y la tinción con el fluorocromo rojo Nilo se presentó como una técnica adecuada para la detección in situ de los lípidos neutros por espectrofluorimetría. Asimismo, la relación entre las intensidades de fluorescencia de la clorofila a y del rojo Nilo se propone como un índice para la estimación del tiempo de acumulación máxima de los lípidos neutros y consecuentemente, para la determinación del tiempo de cosecha de la biomasa. El efecto de las variables ambientales sobre los parámetros de crecimiento indicó que a mayor temperatura (25º C), mayor intensidad de luz (300 μmol fotón m-2 s-1) y con un fotoperíodo de 16:8 h L:O, la especie mostró un aumento de la velocidad de crecimiento (0,85 div d-1) a escala de laboratorio. Sin embargo, la producción de biomasa (680 mg L-1) no se incrementó en respuesta a la intensidad de luz más alta. Bajo las condiciones ambientales testeadas en este estudio, el contenido de lípidos totales (LT) de N. oceanica CCALA 978 fue en general alto (24-34%), y esto se debió a una alta proporción de los lípidos neutros (LN), los cuales representaron entre un 82% y 91% de los LT. No obstante, los mayores contenidos lipídicos se obtuvieron, cuando las células crecieron en un medio de cultivo carente de nitrógeno, a ambas intensidades de luz y un fotoperíodo de 16:8 h L:O (LT: 36% peso seco de biomasa [ps] y LN: 32% ps). Bajo estas condiciones, se alcanzaron productividades de LT y LN de 48 mg L-1 d-1 y 43 mg L-1 d-1, respectivamente. Con respecto a la calidad de los lípidos, los ácidos grasos saturados (AGS) y monoinsaturados (AGM) fueron las clases predominantes dentro de los LN, bajo todas las condiciones testeadas, representando conjuntamente entre el 90-96% de los ácidos grasos totales. Los AGS-LN aumentaron a 25°C, 16:8 h L:O y 300 μmol fotón m-2 s-1, mientras que los AGM-LN disminuyeron en respuesta a estas variables. Los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) fueron la fracción minoritaria en todas las condiciones de cultivo testeadas. La composición de los ácidos grasos fue similar en todas las condiciones de cultivo probadas, tanto en los lípidos totales como en los lípidos neutros, siendo los principales ácidos grasos el ác. palmítico (C16:0), el ác. palmitoleico (C16:1), el ác. oleico (C18:1n9c) y el ác. eicosapentaenoico (C20:5n3). El ácido palmítico fue el componente mayoritario de los AGS, tanto en los LT como en los LN, e incrementó de manera significativa en función de la mayor temperatura, la mayor intensidad lumínica y la mayor duración de las horas de luz empleados. Dentro de los AGM, el ácido palmitoleico fue el más abundante en todas las condiciones de cultivo en los LT y LN. Se observó un disminución significativa con la temperatura más alta empleada (25°C) y la mayor duración de las horas de luz (16:8 h L:O). El ácido eicosapentaenoico fue el principal componente de los AGP en los LT y LN. Sin embargo, sus valores no superaron el 5%. En relación a los parámetros de calidad del aceite, el índice de Yodo, el número de cetano y el contenido de ácido linolénico estuvieron dentro de los límites establecidos por el estándar de calidad europeo EN14214. Estas características permiten inferir que los aceites de N. oceanica CCALA 978 se presentan como una materia prima adecuada para la producción de biodiesel. En la experiencia de cultivo de N. oceanica CCALA 978 en el fotobiorreactor columnar, se obtuvo un crecimiento sostenido de la cepa con el medio SWES, alcanzando 1,11 g L-1 de biomasa. Sin embargo, la intensidad de luz empleada y el diseño del fotobiorreactor constituyeron un impedimento para maximizar la producción de biomasa. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluye que la cepa nativa Nannochloropsis oceanica CCALA 978 es una microalga oleaginosa y robusta, y por lo tanto se la puede proponer como una fuente microalgal potencialmente útil de aceites para procesos de producción de biodiesel. Además, la información derivada de este trabajo representa una base para la implementación de nuevas estrategias de cultivos con fines bioenergéticos, tendientes a incrementar la biomasa, los contenidos de lípidos y las productividades lipídicas, condiciones indispensables para lograr un proceso potencialmente rentable.