Regulación de la migración, proliferación y diferenciación de osteoblastos de rata por el trifosfato de adenosina : rol de receptores P2 y mecanismos de señalización - Laiuppa, Juan Andrés (2017)
Existe una gran cantidad de patologías que afectan al esqueleto, en las que se ve comprometido el balance entre la formación y la resorción ósea. Generalmente, las alternativas terapéuticas apuntan a la modulación de la resorción ósea actuando a nivel del osteoclasto. Sin embargo, estos abordajes terapéuticos no resultan suficientes, generando la necesidad de implementar nuevas estrategias farmacológicas con blanco de acción en la fisiología de la célula formadora de hueso, el osteoblasto. Para ello, un extensivo y detallado conocimiento tanto de la función como de los procesos de proliferación, migración y diferenciación, de la citada célula, son necesarios. El sistema de señalización purinérgico, donde los nucleótidos son liberados por las células, de manera controlada, y actúan como mensajeros extracelulares activando receptores purinérgicos en la membrana plasmática de la célula blanco es conocido desde hace unos 45 años. Desde entonces, se ha reportado un número creciente de células capaces de liberar nucleótidos, de manera controlada, al medio extracelular, lo que sumado al hecho de que, virtualmente, todas las células del cuerpo poseen algún tipo de receptor purinérgico (purinoceptor), hace de este sistema de señalización uno de los más importantes respecto de la regulación de la homeostasis del cuerpo. El papel de los nucleótidos y sus receptores en los procesos de proliferación y diferenciación de los osteoblastos ha sido estudiado desde hace unos 25 años. Sin embargo, aún no se ha alcanzado la dilucidación completa de los mecanismos regulatorios de estos procesos. El objetivo de esta tesis fue determinar los efectos de la activación de receptores purinérgicos, por nucleótidos extracelulares, en los procesos de migración, proliferación y diferenciación celular de cultivos primarios de calvaria de rata neonata. Se investigó también, el efecto de una concentración elevada de calcio extracelular en la proliferación y diferenciación celular y su influencia en la regulación de dichos procesos por la estimulación purinérgica. Además, se evaluó el rol de la enzima GSK3 (por inhibición con Litio), en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Por último, se examinó el efecto de los agonistas mencionados sobre la expresión y localización de β-catenina. La migración celular fue evaluada mediante “ensayo de la herida”. El tratamiento con los nucleótidos mostró estimular la migración de las células calvariales. Para estudiar el proceso de proliferación se recurrió a citometría de flujo, recuento en cámara de Neubauer y tinción con Cristal Violeta. Los resultados obtenidos le atribuyen efectos positivos a los nucleótidos extracelulares. Por otro lado, el tratamiento con Litio provocó disminuciones en la capacidad proliferativa de las células. Mientras que no se observaron cambios en la proliferación por incubación de las células en un medio con elevada concentración de Calcio extracelular. El análisis de la diferenciación de las células a un fenotipo osteoblástico se llevó a cabo mediante mediciones de actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina, cuantificación de ARNm de marcadores de maduración/diferenciación osteoblástica por QRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa) y detección de mineralización por tinción con rojo de Alizarina. Al respecto, el tratamiento con ATPγS exhibió un rol pro-osteogénico, al elevar la actividad enzimática de FAL, la expresión génica de marcadores de diferenciación y la capacidad mineralizante. En cambio, el agonista UTP no indujo cambios en la actividad de la enzima y, en la mayoría de los casos, reprimió la transcripción de genes osteogénicos. Por su parte, la exposición a Litio incrementó la actividad de FAL pero reprimió la expresión de genes osteogénicos y disminuyó la mineralización de los cultivos. Una elevada concentración de Calcio extracelular mostró efectos positivos a nivel de diferenciación, al incrementar la actividad FAL y la mineralización de los osteoblastos. Finalmente, el tratamiento de los cultivos con nucleótidos extracelulares, en un medio conteniendo elevada concentración de Calcio, mostró leves efectos aditivos/sinergísticos en la estimulación de la diferenciación a células formadoras de hueso. La expresión de β-catenina resultó aumentada bajo tratamiento con nucleótidos extracelulares, Litio o Calcio. Asimismo, la translocación a núcleo se vio incrementada por dichos tratamientos. De acuerdo a los resultados obtenidos en esta tesis, puede atribuirse un rol regulatorio sobre la fisiología osteoblástica al sistema de señalización purinérgico y GSK3/ β-catenina.