Proteínas del ciclo del hierro y su integración regulatoria - Fernández Delias, María Florencia (2024)
El objetivo de este trabajo de tesis fue estudiar la coordinación regulatoria de proteínas que participan en la movilización y depósito de hierro a través de las membranas celulares, en condiciones experimentales de balance y desbalance del ciclo del biometal. Los objetivos planteados se analizaron con un concepto fisiológico y fisiopatológico integrativo en un Modelo in vivo de ratón, desarrollando un Modelo Animal de Sobrecarga de Hierro, combinándolo con eritropoyesis activa inducida por eritropoyetina, y en un Modelo in vitro de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y de Sobrecarga de Hierro con citrato amónico férrico (FAC) o peróxido de hidrógeno (H2O2), previamente tratadas con eritropoyetina o N acetyl cisteina (NAC). Los modelos de Sobrecarga de Hierro con las estrategias experimentales diseñadas nos posibilitaron estudiar la respuesta de las proteínas del Ciclo de Hierro frente a los cambios inducidos, evaluando la expresión de las siguientes proteínas: importador de metales divalentes 1 (DMT1); importador ZIP14 (SLC39A14); receptor de Transferrina 1 (RTf1); receptor de Transferrina 2 (RTf2); proteínas regulatorias como la proteína de la hemocromatosis (HFE) y Prohepcidina; proteínas de depósito de hierro como L y H Ferritina; Hemosiderina. Para la identificación de proteínas y la evaluación de su expresión y localización se utilizaron métodos inmunohistoquímicos, inmunocitoquímicos y de inmunofluorescencia. La optimización del Modelo Animal de Sobrecarga de Hierro con inducción de eritropoyesis activa se evaluó mediante la determinación de parámetros hematológicos y estudios morfológicos del bazo como el principal órgano eritropoyético extramedular murino en el ratón adulto. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en el bazo se observó un significativo aumento de la expresión citoplasmática de proteínas responsables de la captación de hierro celular (DMT1 y ZIP14) y de las proteínas de depósito Ferritina y Hemosiderina y de la proteína reguladora Prohepcidina. Estos cambios ponen en evidencia la inducción de un mecanismo inhibitorio de liberación del hierro celular, que estaría mediado por el eje hepcidina-ferroportina. En estas condiciones experimentales, el exceso de hierro induce el aumento en la expresión de Prohepcidina que, como principal hormona regulatoria, degrada la Ferroportina, única proteína que induce la liberación del hierro celular vía proteosomal previa ubiquitinización, originando, como consecuencia, la retención celular de hierro. Por el contario, en el modelo de Sobrecarga de Hierro combinado con eritropoyesis activada por EPO se redujo la expresión de estas proteínas sugiriendo que la activación de la eritropoyesis induce la liberación de hierro, lo que indicaría que EPO es la señal predominante, sobre la señal de hierro, que preponderó en el modelo combinado. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro duodenal la marcada localización perinuclear de DMT1 y la disminución de la expresión citoplasmática de ZIP14, inducen la reducción de la absorción de hierro dietario, como un mecanismo protector para limitar la captación del biometal ya que el mismo se encuentra en exceso, en este sentido DMT1 sigue la señal de EPO y ZIP14 sigue la señal de hierro. En el tejido duodenal la administración de EPO reveló la evidente localización apical de DMT1 y la marcada expresión citoplasmática de ZIP14, que indicarían que la eritropoyesis activó la captación del hierro de la dieta para cubrir las necesidades de la síntesis de eritrocitos. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en hígado se observó un evidente aumento de la expresión citoplasmática de ZIP14, responsable de la captación de hierro celular y de la expresión de las proteínas de depósito, L ferritina y hemosiderina, y de prohepcidina indicando aumento de la captación celular de hierro, de los depósitos del mismo y la inhibición de la liberación del hierro celular por el eje hepcidina-ferroportina en estas condiciones experimentales. Por el mecanismo descripto se le puede adjudicar al hígado la función de órgano de depósito de hierro. El hígado desarrollaría un efecto regulador o protector de la captación del hierro en exceso que se deduce de la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser mediada por hepcidina, inhibiendo así la captación de hierro en exceso. En el Modelo de Eritropoyesis la presencia de eritropoyetina depleciona los depósitos hepáticos de hierro para utilizarlo en la eritropoyesis activa estimulando la liberación del biometal desde los hepatocitos via el eje hepcidina-FPN. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro la corteza renal mostró aumento de su captación y elevados depósitos en forma de L ferritina y Hemosiderina mediados por el importador ZIP14. Asimismo, se observó aumento de la expresión de prohepcidina. Al igual que en hígado la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser regulada por hepcidina no logró contrarrestar el exceso de la captación de hierro por el aumento de la expresión de ZIP14. Entre los órganos particularmente susceptibles al exceso de hierro se pueden mencionar, corazón, pulmón y páncreas. Nuestros estudios muestran que el importador ZIP14 cardíaco no tuvo cambios de expresión y localización por el efecto de hierro y EPO mientras que DMT1 disminuyó su expresión como en otros tejidos frente al estímulo del exceso del biometal. Podemos concluir que en corazón el exceso de hierro no estaría mediado por los importadores ZIP14 y DMT1. Asimismo, en el Modelo de Eritropoyesis activa, la eritropoyetina tendría un rol protector en corazón disminuyendo los niveles de los depósitos de hierro independientemente de DMT1 y ZIP14 aumentando la liberación de hierro. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en pulmón, el aumento en la captación celular de hierro estaría mediado por la localización apical de DMT1 y el aumento de la expresión citoplasmática de ZIP14. En presencia de EPO se observó redistribución de DMT1 al citoplasma celular y disminución de la expresión de ZIP14, disminuyendo la captación de hierro cuando coexisten sobrecarga y EPO. En el Modelo de Sobrecarga de Hierro en el páncreas endócrino se observó la disminución de la expresión de DMT1 y del Receptor de Transferrina 1 (Rtf1) lo que indicaría la existencia de un mecanismo protector en islotes de Langerhans para disminuir la captación de hierro en exceso. Mientras que en páncreas exócrino los acinos incorporan el hierro vía el aumento de la expresión de ZIP14 depositando el hierro en exceso en las proteínas de depósito L-ferritina y hemosiderina. En presencia de EPO en islotes de Langerhans se podría estimular la captación celular de hierro mediada por el evidente aumento de la expresión de DMT1. En presencia de EPO en acinos pancreáticos la marcada disminución de la expresión de ZIP14 podría explicar la disminución de la captación de hierro. Podemos concluir que, en presencia de hierro y EPO, el páncreas endócrino es regulado por el mecanismo que responde a la señal hierro mientras que el páncreas exócrino es regulado por la señal EPO y de esta forma disminuye los depósitos de hierro ante la gran demanda de la eritropoyesis activa. En los estudios del Modelo de Sobrecarga de Hierro en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y realizados en ausencia de NAC, se vio que el exceso de hierro induce la muerte neuronal mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) mientras que en presencia de NAC se revierte el efecto sobre la viabilidad celular inducido por FAC y la expresión de las proteínas clave del ciclo de hierro. En exceso de hierro si bien se observó la disminución de la expresión de DMT1 que podría ser mediada por hepcidina, el cambio observado no logró proteger a las células neuronales del exceso debido a la incorporación del biometal mediada por el aumento de la expresión de ZIP14 y la endocitosis de RTf1. Una hipótesis posible que explicaría el exceso de hierro neuronal es el aumento de la expresión de prohepcidina en Sobrecarga de Hierro que inhibe su liberación celular mediante el eje hepcidina-FPN. Un hallazgo a destacar de nuestros estudios fue demostrar por primera vez por inmunofluorescencia la vía de señalización neuronal que induce el aumento de la síntesis de hepcidina mediada por la colocalización de HFE y RTf2. En presencia de eritropoyetina se observó un aumento significativo de la viabilidad celular, sin embargo, ese mecanismo no sería mediado por las proteínas clave del ciclo del hierro, pero podría involucrar otras vías de señalización como las proteínas antiapoptóticas. Los estudios en sistema nervioso permitieron demostrar que este tejido posee los mecanismos necesarios para almacenar hierro en exceso. Los estudios realizados en las regiones como estriado, hipocampo, sustancia negra y cerebelo mostraron la disminución de la expresión de DMT1 y el aumento de la expresión de ZIP14 en concordancia con lo observado en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Sin embargo, serán necesarios futuros estudios para comprender la homeostasis del hierro y su regulación en el sistema nervioso. Finalmente, la relación entre el hierro y las proteínas que regulan el ciclo del hierro en las células de los modelos estudiados contribuirán a la mejor comprensión de los mecanismos que participan en la fisiología y fisiopatología del ciclo del hierro. La acción protectora de EPO en células neuronales y en los diferentes tejidos estudiados abre un futuro prometedor para adjudicarle a esta hormona un posible rol en el tratamiento de enfermedades asociadas con desordenes de exceso de hierro.