Cultivo y propiedades medicinales de Grifola gargal y Grifola sordulenta - Postemsky, Pablo D. (2012)
Los hongos son fuente de alimento y medicina desde tiempos remotos. Por su valor nutracéutico y como fuente de nutricéuticos se han utilizado para mantener y mejorar la salud, preservar la juventud y promover la longevidad. También son fuente de compuestos químicos bioactivos útiles para la preparación de productos farmacéuticos. De las 700 especies de hongos comestibles investigadas, sólo unos 50 hongos tienen valor medicinal y entre ellos Grifola frondosa es uno de los más notables e investigados, especialmente como estimulador del sistema inmune y por sus propiedades antitumorales en la lucha contra el cáncer. En los bosques andino patagónicos de Argentina y Chile existen dos representantes del género Grifola: G. gargal Singer y G. sordulenta (Mont.) Singer, para los cuales no se ha investigado suficientemente sobre su biología y por lo tanto no se ha desarrollado aún una tecnología apropiada para su cultivo, como tampoco se han hecho estudios sobre sus posibles propiedades medicinales y aplicaciones no solo terapéuticas sino también biotecnológicas. Por ello se investigó la factibilidad de cultivarlos en condiciones controladas y a su vez se profundizó en el conocimiento de distintos aspectos biológicos de interés. Por otra parte, la actividad medicinal hallada en políporos y en especial en Grifola frondosa apoya la formulación de la hipótesis que plantea también la presencia de actividad antioxidante y/o antigenotóxica en estas especies. La confirmación de tales propiedades es necesaria para sostener más investigación sobre su uso medicinal y resulta de importancia en la propuesta de posibles variedades de productos a partir de ellos, lo cual otorgaría un plus como valor agregado de estos hongos. Para comprender aún más las condiciones de crecimiento de estas especies se realizaron cuatro campañas recorriendo diferentes bosques de robles del Parque Nacional Lanín. Allí, con la ayuda de residentes del lugar y micólogos, se pudieron recolectar fructificaciones sólo en determinados lugares, así como también se tomaron datos de las colonias en crecimiento y muestras de G. gargal causando podredumbre. Asimismo, se aislaron dos cepas (cepa B y G9) de G. gargal, una proveniente de un árbol en pie y otra tomada de un roble caído que llevaba más de 20 años produciendo fructificaciones. La historia de los bosques de roble, informada por otros autores, revela que durante la última glaciación fueron fragmentados y en consecuencia se desarrollaron procesos de variabilidad genética entre los mismos. Algunas de estas variables son el contenido y calidad de ciertos compuestos polifenólicos los cuales se sabe que son importantes en la biología de los hongos degradadores de la madera. En consecuencia esto indicaría una variabilidad entre cepas de los diferentes bosques de robles para G. gargal. Dos cepas, correspondientes a G. gargal (cepa A) y G. sordulenta, fueron obtenidas del Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Hallar las condiciones óptimas en la producción de micelio y cuerpos fructíferos es un paso fundamental para la producción optimizada de los compuestos con valor nutricional, y como fuente de nutricéuticos y fármacos hipotéticamente presentes en estos hongos. El análisis del crecimiento micelial de G. gargal y G. sordulenta en agar nutritivo reveló que para ambas especies, las mejores condiciones de cultivo fueron pH 4, 18ºC y medio de cultivo MYPA 16 suplementado con 0,4% de cáscara de girasol en polvo. Así, fue posible disminuir el tiempo para la obtención de inóculo de excelente calidad y el cultivo de las cepas en este medio fue posteriormente utilizado en forma rutinaria para su mantenimiento y para su uso como inóculo. Los resultados presentados fueron analizados por una posible pérdida de vigor (luego de tres años de subcultivos) y se halló que ambas cepas no perdieron vigor y que además hubo una mejora en la velocidad de colonización por G. sordulenta y ello se puede explicar por haber desarrollado una adaptación a los ingredientes del medio, concluyendo que las condiciones de rutina empleadas fueron adecuadas para conservar su vigor por más de 12 subcultivos. El aumento en contenido de polvo de cáscara de girasol no modificó la velocidad de colonización de la cepa A de G. gargal por lo que no se justifica su aumento en el medio de cultivo por encima del 0,4 % para esta especie; no se encontraron diferencias en la velocidad de colonización entre las cepa A, B y G9. Usualmente se observa en el stock de cepas de los laboratorios de micología que algunas cepas producen primordios y/o verdaderos cuerpos fructíferos un tiempo después que son almacenadas. Esto llevó a utilizar este método de cultivo in vitro en condiciones controladas para dilucidar los procesos que subyacen en la morfogénesis fúngica, i.e.: la diferenciación del micelio vegetativo a micelio reproductivo. Las observaciones realizadas con lupa y microscopio a G. frondosa, G. gargal y G. sordulenta, fueron comparadas con las observaciones realizadas por otros autores en la bibliografía hallándose algunas diferencias de importancia taxonómica en cuanto a velocidad de crecimiento, morfología de las colonias, cambios de coloración en el medio de cultivo y tipo de degradación de compuestos fenólicos, estudiada in vitro. El aspecto al microscopio de las hifas generativas, gloeopleuras, esqueletales, presencia de clamidosporas y estructuras cristaloides, también en comparación con las observaciones de otras investigaciones, indicó algunas diferencias que permiten conocer mejor la variabilidad entre cepas de estas especies. El estudio de las formaciones morfogénicas in vitro de G. gargal y G. sordulenta fue útil para detectar cambios producidos en estos cultivos luego de aplicar diferentes condiciones lumínicas. La irradiación con luz blanca durante el crecimiento vegetativo de G. gargal previno una demora significativa del crecimiento de micelio en cajas de Petri causadas por temperaturas desfavorables (c.a. 21ºC). Las diferentes condiciones de luz produjeron cambios en el metabolismo secundario y en la diferenciación morfogénica de los cultivos. La respuesta a estas condiciones lumínicas fue mayor en G. gargal que en G. sordulenta. Los resultados indicaron que ambas especies de Grifola fueron sensibles a la irradiación lumínica, con respuestas morfogénicas de distinto tipo e intensidad, si bien la luz blanca fue más efectiva. En ausencia del estímulo luminoso, ambas especies del género fueron capaces de mostrar eventos morfogénicos. En el caso de G. gargal, en presencia del estímulo luminoso, la cepa A fue más sensible que la B en la presentación de respuestas fotomorfogénicas. Estos resultados registrados para los distintos anchos de banda de irradiación lumínica son sugerentes de la participación de más de una molécula fotorreceptora. Para estimar la capacidad ligninolítica in vitro, se cultivó G. gargal y G. sordulenta en medios diferenciales conteniendo diferentes compuestos fenólicos. Para fines comparativos y para poder extrapolar los resultados al cultivo, resultó útil realizar este estudio en forma simultánea con otras dos especies poliporales que tienen una buena performance en fermentaciones en estado sólido empleando cáscara de girasol como sustrato: G. frondosa y Ganoderma lucidum (dos cepas). El estudio reveló la expresión de enzimas polifenol oxidasas en diferentes momentos del crecimiento y con diferentes patrones. Se sugiere que una de estas sería la enzima lignina peroxidasa (LiP). En otro estudio se verificó la actividad de lacasas. Asimismo, la presencia de la enzima con actividad de Mn-peroxidasa (MnP), fue también detectada, ya que en presencia de 20 ppm de Mn(II) en sustratos a base de cáscara de girasol la velocidad de crecimiento micelial fue mayor; asimismo en el caso de G. sordulenta causó un aumento en la densidad micelial aparente. En otro análisis similar se estudió el crecimiento de estas especies en medios diferenciales conteniendo diferentes fuentes de carbohidratos para determinar la actividad de la enzima celobiosa deshidrogenasa. El crecimiento fue en todos los casos moderado a bajo. Se determinó que G. gargal crece mejor en xilulosa y pectina, lo cual indicaría una preferencia por la fracción hemicelulósica de los sustratos. Grifola sordulenta por su parte, crece bien en celulosa y xilulosa y presentó actividad de la enzima celulosa deshidrogenasa. La velocidad de crecimiento y la densidad de la colonización en los medios de carbohidratos fue mayor en las colonias de G. frondosa y Ganoderma lucidum superando a G. gargal y G. sordulenta que si bien crecieron en todos los medios, mostraron menor habilidad para colonizarlos. Por lo cual ambos estudios en medios diferenciales mostraron una menor performance in vitro, lo cual permitió prever un desempeño regular a bajo al extrapolar estos resultados al cultivo en sustratos basados en cáscara de girasol. En algunas especies el cultivo de micelio en medios líquidos ofrece ciertas ventajas como reducción de las pérdidas por contaminación, utilización de espacios más reducidos, y fácil recolección de la biomasa y de los metabolitos disueltos en el medio. Se realizaron cultivos de G. gargal y G. sordulenta en medio líquido agitado empleando Erlenmeyers de 250 ml y 500 ml, y frascos de 3 l, así como también en medio líquido estacionario empleando fuentes de vidrio de 4 l. Se compararon los diferentes sistemas considerando el trabajo que requiere cada técnica y la cantidad de biomasa que produce. Para G. gargal se encontró favorable el cultivo en frascos de 3 l, y para G. sordulenta en Erlenmeyers de 250 ml, obteniéndose una biomasa de 4 y 18 g/l en 20 días de cultivo, respectivamente. En ambas especies la temperatura óptima para este cultivo fue de c.a. 18ºC. En este trabajo se determinó que la suplementación con diferentes reguladores del crecimiento vegetal y/o vitaminas o aminoácidos, o sólo con bencilaminopurina (0,1-10 mg/l) a los medios de ambas especies no incrementa significativamente la biomasa. Por otra parte, mediante el empleo de inóculo homogeneizado se consiguió disminuir la variabilidad dentro de los tratamientos en comparación con el uso de discos de micelio cultivado en agar como inóculo. Los diferentes protocolos suministraron material micelial con diferentes cualidades para ensayar posteriormente las propiedades antioxidantes de estas especies. El spawn en granos es el material que se emplea para inocular grandes masas de sustrato en el cultivo de hongos. La evaluación del crecimiento de micelio de G. gargal y G. sordulenta mediante el bioensayo de crecimiento lineal de Duncan (1997) reveló que ambas especies pueden ser cultivadas en granos de trigo, girasol, maíz y combinaciones de trigo con mijo y maíz con girasol; se determinó que el mejor crecimiento se logra para ambas especies con el cultivo en granos de trigo en el rango de pH de 5,3 a 6,4. La colonización completa de los granos de trigo, según la técnica de producción habitual en botellas de un litro, se produce más rápidamente a 24ºC, en comparación con el crecimiento del micelio en medios semisólidos y líquidos (c.a. 18ºC). En el cultivo en granos no se hallaron diferencias en el número de botellas que completaron la colonización a los días 25 y 30. Para ambas especies y para todos los tipos de granos, la mayor proporción de botellas colonizadas se observó a los 30 días. Considerando la cantidad de granos por gramo de spawn, el empleo de granos de trigo es el más indicado. Se empleó el test de crecimiento lineal de Duncan para evaluar la velocidad de colonización, la densidad aparente, el incremento del contenido de proteínas y de actividad de lacasas, y la degradación de fibras de G. gargal y de G. sordulenta en 20 formulaciones de sustrato a base de cáscara de girasol. Seguidamente se realizó otro ensayo para estudiar el efecto de ciertos suplementos en la velocidad de colonización y densidad aparente en 10 formulaciones más. Con la información recolectada se puede afirmar que ambas especies pueden crecer en estos sustratos, que la cáscara de girasol no necesita suplementos, como salvado o sustrato gastado de Pleurotus ostreatus, para sostener un buen crecimiento del micelio. Para G. gargal la colonización mejoró con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (Mn(II) y Zn(II)), o de otras fuentes lignocelulósicas como roble, álamo o paja de trigo; para G. sordulenta se encontró que la colonización mejora sólo en cuanto a la densidad con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (NH4(I), Mn(II) y Zn(II)). Con el establecimiento de un cultivo axénico de G. gargal y G. sordulenta sobre troncos sintéticos artificiales empleando cáscara de girasol como sustrato, se encontró que ambas especies pueden colonizar bien el sustrato, si bien con un ciclo productivo más extenso y mayor riesgo de contaminación a posteriori que para otras especies cultivadas con la misma técnica. La inducción con choque térmico a 5ºC produjo una sensible inducción de primordios, y se lograron algunas fructificaciones. El intercambio gaseoso es crucial para el desarrollo de los basidiomas, como era esperable según los antecedentes registrados en la literatura sobre la producción de G. frondosa. La secuencia de producción de ambas especies en las diferentes etapas es similar a la de G. frondosa: primordios granulares grises, que luego se diferencian en fructificaciones que se suceden en formas conocidas como cerebro, coliflor y racimo. Las propiedades antioxidantes de extractos metanólicos de cuerpos fructíferos, micelio de cultivo líquido y/o de cultivo de granos de trigo fueron analizadas en cuanto a sus propiedades de extinción de radicales (radical DPPH), y poder reductor, asimismo también se comparó el contenido de compuestos fenólicos y se caracterizaron los extractos metanólicos con la técnica de cromatografía de capa delgada. Los resultados hallados permitieron conocer las propiedades antioxidantes de G. gargal y G. sordulenta. Estas especies resultaron poseer muy buenos atributos antioxidantes, especialmente poder reductor. Las diferentes bioformas de micelio y también las formas de cultivo modifican cuali y cuantitativamente el contenido de antioxidantes causando variaciones en la actividad secuestrante de radicales y en el poder reductor. También se encontró que el micelio puede ser inducido a modificar su contenido en antioxidantes usando reguladores de crecimiento vegetal, y que la variación en el contenido de una propiedad antioxidante es independiente de la producida en otra propiedad antioxidante. La actividad antioxidante se debió en parte a la presencia de compuestos fenólicos pero no fueron los únicos compuestos activos. El análisis de cromatografía de capa delgada reveló además que la mayoría de los compuestos antioxidantes eran de naturaleza polar, en éstos siempre se hallaron las características de revelado correspondientes a compuestos fenólicos, y además en algunas bandas también se reveló la presencia de flavonoides. Por su parte los metabolitos apolares se observaron en todos los cromatogramas de los extractos. En algunos casos podría asociarse a compuestos fenólicos, mientras que en otros podría deberse a metabolitos no fenólicos. En G. sordulenta se halló que la actividad antioxidante estuvo parcialmente asociada a compuestos flavonoides. Las propiedades antigenotóxicas de cuerpos fructíferos y micelio de cultivo líquido de G. gargal; así como las harinas de granos de trigo fermentados con G. gargal, G. sordulenta y/o G. frondosa, fueron estudiadas con el test de mutación y recombinación somática en Drosophila melanogaster. El agente químico utilizando para causar las mutaciones (promutágeno) fue el DMBA (7-12-dimetilbenzo(α)antraceno). Con el estudio de la toxicidad de DMBA en distintos tratamientos pudo observarse un incremento en la mortalidad de las larvas de 9 a 45%, sin embargo cuando se agregaron los extractos fúngicos esta mortalidad disminuyó. La mutación y recombinación se evaluó como el número de spots blancos por cada cien ojos, mostrando un aumento en la frecuencia en aquellos tratamientos que contenían DMBA, y una disminución en los co-tratamientos conteniendo ambos: DMBA, y extractos fúngicos en el siguiente orden: fructificación de G. gargal, las tres harinas de granos colonizados y micelio de cultivo líquido de G. gargal. Se concluyó que el material evaluado resultó no tóxico per se y en combinación con el promutágeno y procancerígeno DMBA pudieron disminuir su mortalidad y la genotoxicidad. La respuesta protectora de los materiales fúngicos activó mecanismos de detoxificación en la larva de D. melanogaster que pueden ser desmutagénicos o bioantimutagénicos, y que fueron causados por ciertos compuestos bioactivos presentes en estos hongos superiores con actividad antigenotóxica como p.e. fenólicos, ácido linoleico, polisacáridos y polipéptidos. Luego de demostrar la ausencia de genotoxicidad, las propiedades antioxidantes y las propiedades antigenotóxicas de G. gargal y G. sordulenta, aun es necesario realizar estudios adicionales sobre la producción de cuerpos fructíferos por medio de la fermentación en estado sólido, y así facilitar su disponibilidad para su consumo como alimento. Hasta entonces una alternativa es la producción de micelio y metabolitos por medio del cultivo líquido. Finalmente, en un apartado final de la tesis se muestra información del contenido mineral y de diferentes nutrientes analizados en muestras de micelio, fructificaciones y granos de trigo colonizados, y como una novedad con potencial biotecnológico se sugiere la obtención de una harina de trigo colonizado por estos hongos para ser empleada como un alimento funcional.