"Roles del factor derivado del epitelio pigmentario durante el desarrollo y regeneración de neuronas fotorreceptoras de retina" - Michelis, Germán Ariel (2023)
Los fotorreceptores (FRs) son las neuronas que capturan la luz en el ojo, por lo que juegan un rol central en la visión. La pérdida progresiva de estas células durante ciertas enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la retinitis pigmentosa o la degeneración macular, conduce a déficits de la visión y eventualmente a la ceguera. Estas patologías, así como otras que afectan al sistema nervioso central, están caracterizadas por la degeneración gradual, selectiva e irreversible de una población neuronal específica. La deficiencia de factores tróficos ha sido involucrada en muchos de estos procesos neurodegenerativos y es característica de la denominada muerte celular programada, tal como la que ocurre al momento de la sinaptogénesis en el desarrollo del sistema nervioso. En efecto, en la retina, así como también en otras partes del sistema nervioso, las neuronas requieren para su supervivencia, de factores tróficos, los cuales provienen de su entorno. El requerimiento de factores tróficos varía según el tipo celular y la etapa del desarrollo. En particular, para los FRs ya se han identificado varios de ellos, incluyendo el Factor Neurotrófico Derivado de la Glía (GDNF), el Factor Neutrófico Ciliar (CNTF), el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), el ácido docosahexaenoico (DHA), la esfingosina 1-fosfato (S1P) y, más recientemente, uno de los principales, el Factor Derivado del Epitelio Pigmentario (PEDF), una proteína con funciones neurotróficas y antiangiogénicas, asociadas a dominios separados de la proteína. La identificación de las secuencias de estos dominios ha permitido diseñar y sintetizar químicamente péptidos estables, como los fragmentos neurotróficos 44-mer y 17-mer, que conservan las propiedades de la proteína nativa y, por ende, de potencial valor médico. Sin embargo, estas características ventajosas requieren ser evaluadas en un modelo experimental adecuado. La mayoría del conocimiento actual sobre el PEDF se ha obtenido gracias a modelos in vivo, donde, debido su inherente complejidad, sumado a la cantidad de interacciones que ocurren entre las células y moléculas de tejidos circundantes, resulta difícil analizar los procesos involucrados. Una alternativa a este obstáculo son los cultivos primarios elegidos para realizar esta tesis, compuestos solo de neuronas amacrinas y FRs, las que, creciendo en medios químicamente definidos, permiten estudiarlas en un entorno mucho más controlado que en el organismo entero. En estos cultivos, los FRs se desarrollan independientemente, sin requerir la suplementación de factores tróficos, pero, una vez establecidas sus conexiones sinápticas, se tornan dependientes de los mismos para continuar con su desarrollo y prolongar supervivencia. La dependencia por estos factores hace de este sistema in vitro un modelo adecuado para evaluar el efecto de distintas moléculas sobre la supervivencia o diferenciación celular. Por ello, los resultados reseñados en el primer capítulo de esta tesis tuvieron como objetivo principal evaluar el efecto de PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico y angiogénico en este modelo de cultivo primario de neuronas de retina. En estos cultivos, tanto los FRs como las neuronas amacrinas exhibieron el receptor de PEDF (PEDF-R), el cual es una fosfolipasa del tipo A2, localizado principalmente en la membrana celular. Por otro lado, la expresión del transcripto para PEDF-R mostró un patrón decreciente durante los primeros 5 días de cultivo, así como también en la retina in vivo, en el mismo periodo de desarrollo. Este patrón se observó también a nivel de la proteína, aunque su descenso en el tiempo fue más atenuado. Tanto el PEDF como los dos péptidos derivados de su dominio neurotrófico, protegieron a los FRs en cultivo de la muerte celular, caracterizada por ensayos de TUNEL y Anexina V. Además, previnieron la pérdida de la función mitocondrial evaluada mediante Mitotracker, y preservaron la integridad estructural de la membrana plasmática, analizada indirectamente por medio de ioduro de propidio y DAPI; dado que estos marcadores se visualizan una vez que se altera la permeabilidad de la membrana plasmática. Esta protección se debió principalmente a la interacción de PEDF con PEDF-R, y, en parte, al aumento constatado en la transcripción de factores antiapoptóticos como Bcl2 y Bcl2a1. El efecto del PEDF fue específico para la supervivencia de los FRs dado que el mismo no alteró la viabilidad de las neuronas amacrinas, la cual se mantuvo constante durante los días de cultivo analizados. Por el contrario, el PEDF y los péptidos 44-mer y 17-mer promovieron el desarrollo de neuritas en las neuronas amacrinas, e indujeron la diferenciación de los FRs, al promover la polarización de la rodopsina hacia el extremo apical de estas neuronas, tal como ocurre en los FRs maduros de la retina in vivo. Estos efectos fueron anulados eficientemente mediante el secuestro de PEDF o de sus péptidos por medio del péptido bloqueante P1, o por la inhibición de la actividad enzimática del PEDF-R mediante el inhibidor enzimático selectivo atglistatin. Todos los efectos del PEDF y sus péptidos neurotróficos fueron asociados a la interacción de los mismos con el PEDF-R. Por su parte, el fragmento derivado del dominio antiangiogénico del PEDF no tuvo ningún efecto. Por otro lado, también se indagó sobre el potencial del epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivado de células madre pluripotentes (CMP) en la producción y liberación del PEDF. Dado que la deficiencia del PEDF ha sido correlacionada con una mayor incidencia de ciertas retinopatías y el hecho que el EPR puede estar comprometido en algunas de estas patologías, ha impulsado el desarrollo de estrategias orientadas a reemplazar el EPR dañado. Entre ellas se destaca la estrategia de generar EPR por medio de CMP obtenidas a partir de la inducción de células somáticas mediante la transducción de factores de pluripotencia por medio de un sistema episomal. Este tipo de estrategia requiere sortear múltiples obstáculos antes de ser viable, particularmente el de garantizar la identidad del nuevo EPR. El objetivo de esta línea de investigación, descripta en el segundo capítulo de esta tesis, fue evaluar los aspectos funcionales del EPR derivado de células madre, comparándolos con los del EPR nativo. El EPR derivado de CMP humanas recapituló las características distintivas del EPR nativo, como la polarización baso-apical, la capacidad de fagocitar y metabolizar segmentos externos de FRs y la producción de PEDF. Todas estas características se mantuvieron aun hasta 50 días después de su inducción, con la producción de PEDF incrementándose significativamente en función del tiempo. En conclusión, el PEDF y los péptidos derivados de su dominio neurotrófico ejercieron efectos citoprotectores y de diferenciación sobre los fotorreceptores y promovieron el crecimiento de neuritas en las neuronas amacrinas. Todos estos efectos fueron dependientes de la interacción entre PEDF y PEDF- R. Por otro lado, el EPR derivado de CMP examinado en este trabajo de tesis mostró un comportamiento similar al del EPR en la retina intacta, lo que permite considerar sus posibles capacidades terapéuticas para estas enfermedades