Estudios comportamentales y farmacológicos en Caenorhabditis elegans : circuitos neuronales implicados en la alimentación - Blanco, María Gabriela (2021)
Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado para responder interrogantes biológicos generales desde hace aproximadamente 60 años. Su fácil manipulación genética, el conocimiento del conectoma completo y la sencillez para estudiar su comportamiento, lo convierten en un excelente modelo para abordar preguntas neurobiológicas fundamentales y realizar ensayos farmacológicos. En esta tesis doctoral, empleamos al nematodo C. elegans como modelo para el estudio de la modulación neuronal de conductas asociadas a la alimentación y para la búsqueda de compuestos con potencial terapéutico. Una adecuada alimentación es esencial para la supervivencia de los animales. El sistema nervioso modula la actividad motora en función de la disponibilidad de alimento en el medio ambiente y del estado nutricional interno. Cuando los animales han experimentado un ayuno prolongado y encuentran comida nuevamente, permanecen en un área pequeña para explotar al máximo la nueva fuente de nutrientes. El estímulo de comida tanto en ratones como en invertebrados produce la liberación de serotonina (5-HT). En C. elegans, la 5-HT modula comportamientos relacionados principalmente con la presencia de alimento: aumenta el bombeo faríngeo y la deposición de huevos y suprime la locomoción. Cuando C. elegans ha permanecido en ausencia de comida por un largo período y retorna al alimento, exhibe un drástico descenso de la velocidad e incrementa el bombeo faríngeo para favorecer la ingesta de comida. Se sabe que la abrupta reducción de la locomoción en el encuentro con el alimento depende de la liberación de 5-HT desde dos neuronas serotoninérgicas denominadas NSM y ADF. Por otro lado, la tiramina (TA) y octopamina (OA), análogos de noradrenalina y adrenalina en invertebrados, respectivamente, son capaces de ejercer efectos opuestos a la 5-HT reduciendo el bombeo faríngeo y la puesta de huevos. A su vez, así como la 5-HT modula comportamientos que favorecen la alimentación en presencia de comida, la OA, por el contrario, regula conductas que son importantes durante el ayuno, como por ejemplo el aumento de la locomoción para facilitar la búsqueda de alimento. Sin embargo, las acciones ejercidas por la TA con respecto a la alimentación y locomoción aún no son del todo claras. A pesar de que existen evidencias de los efectos antagónicos entre las vías serotoninérgicas y tira/octopaminérgicas, los mecanismos y significancia de esta interacción aún no se conocen con exactitud. Es así que, mediante técnicas de biología molecular, microscopia, ensayos comportamentales y farmacológicos, nos propusimos estudiar el rol de estas aminas biogénicas en la conducta de alimentación en C. elegans. Mediante ensayos de comportamiento, observamos que mutantes nulos tdc-1, deficientes de la síntesis de TA, aun estando bien alimentados, son hipersensibles a la disminución de la locomoción en el encuentro con el alimento (lo cual se asemeja al comportamiento de animales hambreados). Esto sugiere que la 5-HT y TA ejercen efectos antagónicos en este comportamiento. Mediante ensayos de imágenes de calcio in vivo, observamos que la actividad del par de neuronas tiraminérgicas (llamadas RIM) disminuye en ausencia de alimento y aumenta paulatinamente en el regreso al mismo. Además, el agregado exógeno de TA durante el ayuno rescata parcialmente la gran desaceleración de la locomoción en la realimentación. Estos resultados en conjunto, nos permiten hipotetizar que la inhibición de la actividad de la neurona tiraminérgica durante el ayuno favorece la exacerbación de los efectos dependientes de la señal serotoninérgica en la realimentación. Finalmente, intentamos caracterizar los mecanismos moleculares involucrados en esta intermodulación. Al evaluar la actividad de las neuronas serotoninérgicas NSM y ADF en animales deficientes de TA, determinamos que la falta de TA exacerba la señal serotoninérgica en la vuelta al alimento. Esto sugiere que la TA inhibe la actividad de las neuronas serotoninérgicas apoyando nuestra hipótesis de que la disminución de la actividad tiraminérgica en el ayuno es necesaria para la exacerbada liberación de 5-HT en la realimentación. Además, de los cuatro receptores tiraminérgicos conocidos (tres GPCRs TYRA-2, TYRA-3 y SER-2 y un canal de cloruro LGC-55), encontramos que tres de ellos están implicados en la modulación de la locomoción a través de un circuito paralelo río abajo de las neuronas serotoninérgicas: los receptores TYRA-2 y TYRA-3 estimulan la locomoción, mientras que SER-2 la disminuye. En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de las neuronas tiraminérgicas durante el ayuno es clave para el comportamiento de los animales en la realimentación. Considerando las similitudes que existen en las conductas de alimentación y a la conservación de los componentes neuronales implicados en su regulación en el reino animal, nuestros resultados podrían colaborar al entendimiento del rol de estas señales no sólo en invertebrados sino también en otros animales. Hemos mencionado además que C. elegans es un excelente modelo para realizar ensayos farmacológicos. Aprovechando esta ventaja y la cercanía evolutiva entre C. elegans y otras especies de nematodos parásitos, realizamos una búsqueda de compuestos con potencial actividad antihelmíntica. Las infecciones producidas por nematodos parásitos generan una sustancial morbilidad en billones de personas y pérdidas considerables del ganado y agricultura. Dado a las deficientes políticas de salud pública y a las malas condiciones de calidad de vida e higiene, estas infecciones afectan principalmente a los países más empobrecidos. A su vez, la aparición de parásitos resistentes en el ganado se ha convertido en una preocupación global y es una complicación emergente en las helmintiasis humanas. A pesar de esto, la industria farmacéutica ha relegado el desarrollo de nuevos antihelmínticos en las últimas décadas. Por lo expuesto, la investigación de moléculas con nuevos mecanismos de acción antihelmínticos es una necesidad urgente. La dificultad para realizar ensayos con parásitos en el laboratorio, la cercanía filogenética con las demás especies dentro del filo nematoda y su fácil manipulación genética convierten al nematodo de vida libre C. elegans en un modelo eficiente para el estudio de moléculas con potencial antihelmíntico. En el segundo capítulo de esta tesis realizamos un cribado de moléculas derivadas del imidazol en C. elegans con el objetivo de identificar nuevos compuestos con acción terapéutica, específicamente con potencialidad antihelmíntica. Encontramos un compuesto, el Diisopropil-fenil imidazol (DII), que produce letalidad selectiva en nematodos adultos, siendo inocuo para células humanas en cultivo HEK-293 y larvas de D. melanogaster. Al presentar un efecto nematicida específico, decidimos estudiar en mayor profundidad su modo de acción. Evaluando la resistencia a la droga de cepas mutadas en genes que codifican para blancos moleculares de antihelmínticos conocidos, encontramos que el DII actúa a través de la subunidad no- UNC-29 de un receptor ionotrópico colinérgico muscular (AChR). UNC-29, junto con las subunidades UNC-38, UNC-63, LEV-1 y LEV-8, ha sido tradicionalmente considerada como parte del AChR de tipo L sensible a la droga antihelmíntica Levamisol (L-AChR). Las drogas, como el levamisol, que actúan como agonistas de receptores ionotrópicos colinérgicos generan la despolarización rápida de la célula muscular y parálisis del gusano. Observamos que el DII no genera estos efectos tradicionales de los agonistas nicotínicos y tampoco desplaza la curva dosis-respuesta del levamisol, como lo haría un antagonista del L-AChR. Además, determinamos que los mutantes deficientes de las demás subunidades que conforman el L-AChR clásico, son sensibles al DII. Estos resultados en conjunto sugieren que el DII actúa a través de un AChR muscular, que contiene la subunidad UNC-29, distinto al L-AChR clásico. Existen suficientes evidencias que avalan la presencia de múltiples clases de AChRs musculares con composiciones de subunidades diferentes distribuidas en el cuerpo del animal. Esto apoya nuestra hipótesis de que el blanco molecular del DII en gusanos adultos podría ser un AChR aún no identificado. En general, las larvas de parásitos son más resistentes a los antihelmínticos clásicos como el levamisol. Sin embargo, determinamos que el DII es letal para las larvas y que existe otro blanco molecular distinto a UNC-29 implicado en este mecanismo. Esto presenta una ventaja terapéutica, ya que antihelmínticos que actúan a través de más de un mecanismo de acción otorgan una terapia más efectiva y retrasan la expansión de resistencias. Creemos que el DII constituye el puntapié inicial para el desarrollo de un compuesto con potencialidad terapéutica. El hecho de que el DII presente actividad nematicida específica y que actúe a través de un blanco molecular diferente al de los antihelmínticos clásicos, sienta las bases para la dilucidación completa de su mecanismo de acción, así como la evaluación de su efectividad en nematodos parásitos. En conclusión, en este trabajo de tesis explotamos la potencialidad del nematodo C. elegans con dos objetivos bien diferentes: 1) en el capítulo I nos centramos en intentar de contribuir con el entendimiento de un interrogante biológico fundamental: ¿cómo los circuitos neuronales producen comportamientos específicos que responden a las necesidades metabólicas del organismo?, y 2) en el capítulo II, con un perfil más aplicado, nos propusimos identificar nuevas moléculas con potencialidad antihelmíntica, que en el futuro puedan ser consideradas posibles terapias antiparasitarias.