Producción de poli(hidroxialcanoato)s (PHA)s a partir de fuentes renovables de bajo costo - Porras, Mauricio Ariel (2016)
Los plásticos se han convertido en el material de mayor y amplio uso en un corto lapso de tiempo. En este sentido, la dependencia de los plásticos derivados del petróleo ha aumentado progresivamente en los últimos años y es una de las causas del problema de la excesiva acumulación de residuos. Los efectos ambientales dañinos provocados por estos plásticos sintéticos han generado un gran interés en el uso y aplicaciones de biopolímeros. Sin embargo, los polímeros de origen biológico representan en la actualidad sólo una pequeña fracción del mercado total mundial de plásticos (menos del 1% del total) y el principal motivo es su alto costo de producción. Los poli(hidroxialcanoato)s (PHAs) son una familia de biopoliésteres de origen natural sintetizados por diversos microorganismos. Las características de los PHAs pueden dar lugar a diversas propiedades adaptables a diferentes aplicaciones industriales que van desde materiales de embalaje biodegradables hasta diversos productos médicos. Esto los convierte en candidatos prometedores de interés industrial y con valor ambiental, ya que además de su diversidad química son biodegradables, piezoeléctricos, biocompatibles, además de ser fabricados a partir de fuentes de carbono renovables. Varios factores influyen en la producción de PHAs, tales como la especie de microorganismo, la duración de la fermentación, la tasa de crecimiento, la naturaleza y concentración de la fuente de carbono. Entre estos, el factor de mayor influencia en el costo de producción es la fuente de carbono. El objetivo de esta tesis fue estudiar y optimizar la producción de PHAs a partir de sustratos de bajo costo y cepas bacterianas aisladas de ambientes costeros de la región de Bahía Blanca. Conjuntamente se propuso desarrollar metodologías rápidas y confiables para evaluar la producción de estos biopolímeros. Con este fin se realizaron aislamientos de cepas bacterianas productoras de PHA de sedimentos del estuario de Bahía Blanca. Por screening cualitativos se determinó la presencia del biopolímero empleando técnicas clásicas de tinción de gránulos internos de PHA. Alternativamente se utilizó una técnica espectroscópica (espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)) para la detección de la presencia e intensidad de picos característicos del PHA en muestras de las cepas aisladas. A partir de este screening se seleccionó la mejor cepa productora de PHA. La cepa seleccionada fue identificada como Bacillus megaterium BBST4, la cual fue aislada de sedimentos de Estuario de Bahía blanca, durante un estudio previo llevado a cabo en nuestros laboratorios. Para realizar los ensayos de optimización fueron seleccionados dos sustratos (glicerol y almidón) teniendo en cuenta el rendimiento en la producción de PHA demostrado por B. megaterium BBST4, y en relación a los costos del medio de cultivo y la fuente de carbono. Como fuente de nitrógeno se seleccionó la urea y un medio de cultivo salino mínimo. Para la optimización de la producción de PHAs a partir de glicerol como fuente de carbono se analizó la influencia de distintas variables en la producción de este biopolímero. A partir del almidón como fuente de carbono se desarrolló la técnica de diseño experimental por medio de una superficie de respuesta (RSM) como herramienta estadística robusta. Para las dos condiciones determinadas por RSM donde se obtuvo la máxima producción de biopolímero, en relación al rendimiento de PHA en cantidad y en economía (menor costo de producción), se desarrolló un modelado matemático de la cinética de producción de estos biopolímeros. Se probaron distintas técnicas de extracción de PHAs a partir de cloroformo como principal solvente de extracción. La técnica de extracción que presentó los mejores resultados fue optimizada y empleada para obtener los PHAs producidos por la cepa estudiada a partir de las dos fuentes de carbono seleccionadas, y a partir de una tercera fuente de carbono para cotejar diferencias entre sí. Estos PHAs fueron caracterizados por FTIR, Resonancia magnética nuclear de una dimensión (1H-NMR y 13C-NMR) y dos dimensiones (HSQC), Calorimetría diferencial de barrido (DSC) y Cromatografía por exclusión de tamaños (SEC o GPC). Los resultados de caracterización mostraron que los PHAs producido por B. megaterium BBST4 a partir de las tres fuentes de carbono presentan aproximadamente un 89,3 mol% de 3HB, un 5,6 mol% de 3HV y un 5,2 mol% de monómeros de mcl-HA, probablemente con extensión interna de la cadena. En nuestro conocimiento, este representa el primer reporte de producción de copolímeros empleando una cepa del genero Bacillus a partir de distintas fuentes de carbono renovables. Finalmente se desarrolló una nueva técnica para la determinación del PHA extraíble a partir de células liofilizadas y FTIR. Esta técnica disminuye notablemente los tiempos de determinación, lo que permite una importante reducción en el tiempo de toma de decisiones a la hora de definir cuantitativamente el/los momentos de óptima producción de PHA para realizar la extracción. Los aportes de esta tesis permiten visualizar un esquema general del proceso de obtención y optimización de la producción de PHAs. Por lo que representan un punto de inicio para el estudio de la biosíntesis de PHAs a partir de sistemas biotecnológicos con diferentes alternativas para la optimización en la detección y cuantificación de estos biopolímeros.