Interruptores moleculares basados en azobencenos y ciclodextrinas : aplicación en sistemas miméticos de factores de transcripción - Quirolo, Zulma Beatriz (2017)
El mecanismo por el cual los sistemas biológicos responden a un estímulo externo es un problema fundamental de la biología moderna. En el caso particular de los factores de transcripción (FT) una señal extracelular conduce a la activación de la expresión de un gen determinado. La motivación de esta tesis surge de la enorme importancia de estas proteínas regulatorias en el funcionamiento celular por lo que es evidente la importancia de comprender las bases moleculares que rigen sus interacciones con el fin último de diseñar estrategias racionales para alterar de forma programable y selectiva la expresión de determinados genes. En este contexto y a través de la combinación de síntesis orgánica, química supramolecular y biosupramolecular en orden creciente de complejidad, es que nos proponemos obtener sistemas miméticos de FT que interaccionen de forma específica con sus ds ADN consenso in vitro. Como objetivo general de esta tesis, estamos interesados en avanzar en el entendimiento del proceso de reconocimiento molecular de sistemas sencillos en medio acuoso, para finalmente trasladar estos conocimientos en el diseño de miméticos de FT. Como objetivos específicos nos propusimos promover la formación de homodímeros no covalentes mediada por un ligando externo y su interacción con secuencias de ds ADN consenso. Pero también estamos interesados en dar los pasos iniciales hacia la heterodimerización de dos fragmentos proteicos a través de la complejación entre ciclodextrinas y azobencenos, así como ciclodextrina y adamantano. En el Capítulo 3, hemos investigado una estrategia de dimerización no covalente de homodímeros de miniproteínas del factor de transcripción GCN4 mediada por el agregado de un receptor alostérico y evaluado la interacción con diferentes ds ADN. Inicialmente, para este fin se sintetizó y caracterizo exhaustivamente un dímero fotomodulable de azo ß-ciclodextrina (4), el mismo se encuentra en dos estados fotoestacionarios, el primero estable termodinámicamente de cuya relación de isómeros E:Z es de 95:5 (azoCyD(E)) y un segundo obtenido luego de irradiar con luz ultravioleta en la una relación E:Z 60:40 (azoCyD(Z)). El dímero 4 fue usado con el fin promover la dimerización de dos monómeros de la región básica del GCN4 provistos de un grupo adamantano en el extremo C-terminal, llamados Ad26 y Ad30 ya que difieren solo en 4 a.a (Capitulo 5). Mientras el péptido Ad26 no presento unión a ninguna secuencia, en ausencia o presencia de 4; el péptido Ad30, es capaz de unir a los ADN consenso luego del agregado de azoCyD(E) a la concentración de 200 nM de monómero. Tanto los experimentos de retardo en gel como los de dicroísmo circulan muestran que el sistema Ad30-azoCyD(E)-Ad30 reconoce específicamente la secuencia consenso 2/2C (CRE, 5’-ATGAcgTCAT-3’), mientras que el sistema Ad30-azoCyD(Z)-Ad30 no es capaz de hacerlo. En el caso de Ad30, es posible establecer un reconocimiento secuencial al ds CRE, donde dímero azoCyD (4) en configuración E mejora la unión promoviendo la dimerización y aumentando así la afinidad del reconociendo. A pesar que estos resultados en cuanto a afinidad son moderados es el primer ejemplo de un mimético del GCN4 que forma un sistema tetra-componente en la interacción con su ds ADN consenso. En cuanto a la estrategia de heterodimerización no covalente, hipotetizamos que el grupo azobenceno podría ser usado como huésped en la complejación de la cavidad de la ciclodextrina y así aprovechar la diferencia de afinidad de ambos isómeros E y Z por la cavidad. Sin embargo como es necesario controlar no solo la organización de los FT en tiempo y espacio y de manera reversible; sino también con una elevada afinidad, es que primero trabajamos con sistemas modelos. Para ello, evaluamos la formación de complejos de α- y β- ciclodextrinas con derivados funcionalizados de forma diferente en las posiciones 4 y 4’ de azobencenos, 14, 15, 16, 17, 18, por RMN. Esta técnica nos permitió determinar no solo las constantes de afinidad sino también la geometría de los complejos por experimentos Off ROESY, como se describe en el Capítulo 4. Así determinamos, que el grupo –NH2COCH3 tiene una afinidad adecuada (Ka de 3000 M-1) por la cavidad de β-ciclodextrina, y una posible fotoisomerización eficiente en agua. Con esta información en el Capítulo 6 hemos sintetizado un nuevo mimético fotomodulable del GCN4 con un grupo azobenceno sustituido con un grupo –NH2COCH3, AZO26. Finalmente, y con motivo de extender la química de miméticos de Ft, hemos sintetizado en fase sólida dos fragmentos de la proteína Id1, que es inhibidor transcripcional del FT MyOD. Luego del corte de la resina y de una laboriosa purificación hemos obtenido dos fragmentos del Id1, H1 (extremo N-terminal) y H2 (extremo C-terminal) puros. Hemos intentado, acoplar a estos fragmentos diferentes moléculas como β-ciclodextrina, azobenceno o adamantano, pero solo hemos sido exitosos en la síntesis y aislamiento del péptido H2Ad, que es una miniproteína mutada de H2 en el extremo N-terminal con el grupo adamantano. Mientras que AZO26 es un candidato mejorado para formar heterodímeros con otro monómero del GCN4 con un grupo β-Ciclodextrina CyD26; todos, los fragmentos de la proteína Id1 podrían ser potenciales inhibidores de la proteína MyoD. Estas moléculas serán probadas en trabajos posteriores. Desde el punto de vista de la ciencia básica esperamos con esta tesis contribuir al avance en el desarrollo de estrategias de diseño, síntesis química y de reconociendo molecular con el objetivo final de obtener miniproteínas controlables a través de estímulos externos.