Caracterización funcional de la GTPasa RhoD mediante el uso de un biosensor basado en FRET

• Autores: Haehnel, Franco Adrián
• Año de publicación: 2026
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Bisbal, Mariano
• Materia: FGF; GAP; GDI; Regulación; Rho GTPasas; NATURAL SCIENCES::Biology
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Fil: Haehnel, Franco Adrián. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Carrera de Ciencias Biológicas; Argentina.
Las proteínas Rho GTPasas actúan como interruptores moleculares y cumplen diversos roles en la regulación de diferentes procesos celulares. Dentro de este grupo, RhoD se destaca como una GTPasa atípica de ciclado rápido (fast-cycling), involucrada en el control de la dinámica de endosomas temprano, la organización del citoesqueleto de actina, el ciclo celular, la división de los centrosomas y la migración celular, entre otros procesos. A pesar de su relevancia biológica, su estudio espacio-temporal en células vivas ha estado limitado por la falta de herramientas que permitan monitorear su actividad con resolución subcelular, dado que las técnicas bioquímicas tradicionales solo ofrecen resultados basados en promedios poblacionales. Para superar esta limitación, el presente trabajo describe la caracterización funcional de un biosensor unimolecular para RhoD, basado en transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). Mediante ensayos de fluorometría, FRET radiométrico y acceptor photobleaching FRET, se confirmó la capacidad del biosensor de generar FRET de manera dependiente de la actividad de RhoD, con valores de actividad basal que se ubicaron consistentemente entre los de sus mutantes constitutivamente activa (G26V) y dominante negativa (T31N), validando así su rango dinámico funcional. A continuación, se evaluó la respuesta del biosensor frente a estímulos celulares. En condiciones de privación de suero, la actividad del biosensor disminuyó de forma significativa respecto a células cultivadas en presencia de suero, mientras que las variantes mutantes no mostraron variaciones apreciables, lo que refuerza la especificidad de la respuesta. Asimismo, la estimulación de fibroblastos con el factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8) indujo un incremento en la actividad de RhoD incluso en ausencia de suero, evidenciando la capacidad del biosensor de detectar señales de activación fisiológicamente relevantes. Además, se demostró que el biosensor es capaz de reportar la actividad de RhoD en células vivas, detectando su activación en filopodios. Finalmente, se demostró por primera vez a nivel celular una regulación negativa de RhoD, que se refleja por la reducción de la actividad del biosensor en células que expresan proteínas GTPase-activating proteins (GAPs) y GDP dissociation inhibitors (GDIs). En conjunto, los resultados de este trabajo consolidan la validación de un biosensor robusto y sensible para RhoD, que supera las limitaciones inherentes a los enfoques bioquímicos clásicos y constituye una valiosa herramienta para distinguir poblaciones subcelulares de RhoD activas e inactivas en su entorno fisiológico.
Fil: Haehnel, Franco Adrián. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Carrera de Ciencias Biológicas; Argentina.