Efecto de triiodotironina en la respuesta inmune iniciada por células dendríticas murinas : mecanismos moleculares y celulares mediados por esfingolípidos y vesículas extracelulare...

• Autores: Negretti Borga, Dana María
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pellizas, Claudia Gabriela; Touz, María Carolina; Cervi, Laura Alejandra; Galiano, Mauricio R.; Alvarez, Sergio Eduardo
• Materia: Células dendríticas; Glandula tiroides; Bioquímica; Enfermedades del Sistema Endocrino; Sistema endocrino; Hormonas tiroideas; Animales de laboratorio; Inmunología
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2024.
Fil: Negretti Borga, Dana María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina
El sistema endócrino es una compleja red de comunicación que regula la homeostasis del organismo en conjunto con los sistemas inmune y nervioso. Las Hormonas Tiroideas (HTs) son indispensables para el desarrollo neuronal y somático de los mamíferos y en la vida adulta controlan la termorregulación y los metabolismos lipídicos, proteicos y de hidratos de carbono. A pesar de los importantes avances en la comprensión de la interacción entre diversas hormonas y el sistema inmune, el papel de las HTs en el inicio de la inmunidad adaptativa era incierto hasta hace algunos años. En este sentido, el laboratorio en el que se desarrolló esta Tesis Doctoral proporcionó la primera evidencia de la expresión de receptores de HTs (TR) en células dendríticas (DCs) derivadas de médula ósea (BM) de ratón, principales células presentadoras de antígenos (APCs) y encargadas de orquestar la respuesta inmune adaptativa. Se demostró que niveles fisiológicos de triiodotironina (T3) incrementan los marcadores fenotípicos de maduración de DCs: MHC-II, CD80, CD86, CD40; y promueven la síntesis y secreción de marcadores de activación como las citoquinas interleuquina (IL)-12, IL-6, IL-23, IL-1β, y TGF-β1. Estos efectos se producen principalmente a través de la isoforma β1 del TR (TRβ1), con localización mayormente citoplasmática, dependiente de la fosforilación de Akt y del factor nuclear de transcripción génica NF-κB, y aparentemente de forma independiente de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). Además, las DCs inmaduras (DCi) estimuladas con T3 (DC-T3) incrementaron la capacidad aloestimulatoria de linfocitos T (LT) en co-cultivos, direccionando la respuesta inmune adaptativa hacia los perfiles citotóxicos y proinflamatorios T helper (Th)1 y Th17 con secreción aumentada de las citoquinas IFN-ɣ e IL-17, disminuyendo la población de células T regulatorias (Treg). Por su parte, los esfingolípidos son componentes ubicuos de las membranas celulares de mamíferos. Estos lípidos pueden metabolizarse rápidamente a través de la activación de cascadas enzimáticas. Sus metabolitos han sido involucrados en múltiples eventos inmunes, de envejecimiento y procesos tumorales, entre otros. En particular, el eje conformado por la enzima esfingosina quinasa 1 (SK1), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y su receptor (S1PR) se han propuesto como mediadores de vías de señalización fisiopatológicas. La acción de la S1P se realiza tanto como mensajero intracelular como a través de receptores de membrana acoplados a proteínas G, lo que explica la complejidad de sus efectos. S1P tienen un papel modulador en el sistema inmune, dependiente de cada célula y del contexto. SK1 ha sido vinculada con la regulación intracelular de vías dependientes de TNF-α y de NF-κB. Los S1PRs están implicados en la regulación de Akt, PKC y STAT3, entre otros mediadores intracelulares. Sin embargo, poco se sabe de los roles del eje SK1/S1P/S1PR sobre el efecto de las HTs en la respuesta inmune. Por otro lado, se ha reportado que las vesículas extracelulares (EVs), nanovesículas lipídicas liberadas por todas las células, transportan en su interior ácidos nucleicos, lípidos y proteínas, y poseen diversas moléculas en su superficie. Las EVs se han postulado como importantes componentes de la comunicación intercelular. En particular, las EVs liberadas por DCs (EV-DC) poseen moléculas MHC-II y coestimuladoras, que les permiten realizar eficientemente la presentación antigénica y activar LT. Las EVs estarían involucradas en el inicio, mantención y regulación de la respuesta inmune. Numerosos reportes y ensayos clínicos proponen potenciales usos de las EVs en la medicina de precisión, como en terapias inmunológicas o como biomarcadores pronósticos y/o predictivos de diversas entidades patológicas. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue profundizar en el conocimiento sobre los mecanismos de acción moleculares y celulares involucrados en los efectos de T3 sobre DCs y la respuesta inmune adaptativa direccionada por estas APCs. En lo particular, este trabajo se dividió en 2 objetivos específicos: 1- Estudiar si la vía de los esfingolípidos participa en el mecanismo involucrado en la acción de T3 sobre DCs y la modulación de la respuesta inmune; y 2- Caracterizar y evaluar la funcionalidad de las EVs derivadas de DC-T3 sobre la respuesta inmune innata y adaptativa. Los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo de Tesis Doctoral refuerzan la hipótesis de que los esfingolípidos participarían, al menos en parte, en el mecanismo de activación de DCs luego de la exposición a T3. En particular, la vía SK1/S1P/S1PR es una mediadora de la fosforilación de Akt en Ser473 inducida por DC-T3, y regula la producción y secreción de IL-12. Demostramos que S1PR regula la secreción de IL-6, pero no SK. En cuanto al rol de los esfingolípidos en la activación de las DC-T3 y la respuesta inmune adaptativa, nuestros resultados sugieren que éstos no parecerían estar involucrados en el mecanismo responsable de la proliferación de esplenocitos ni en el perfil Th1, al menos en las condiciones estudiadas en este trabajo. Sin embargo, demostramos que la vía SK1/S1P/S1PR en DC-T3 regula la respuesta Th17. Por su parte, los resultados obtenidos en la segunda parte del trabajo de Tesis Doctoral indican que cuando las DCs son expuestas a T3 producen EVs con características bioquímicas y fenotípicas acordes a los estándares internacionales establecidos hasta el momento. Además, están involucradas en la comunicación parácrina entre DCs, ya que amplifican la señal inicial generada. En particular, demostramos que tanto EV-DC-T3 como EV-DCi, poseen la capacidad funcional de activar en forma parácrina DCi singénicas con producción de IL-12p70. Por su parte, EV-DC-T3 expuestas a esplenocitos alogénicos muestran una tendencia a aumentar la población de LT CD8+ (citotóxicos). Además, las EV-DC-T3 modifican la secreción de citoquinas proinflamatorias IL-17 e IFN-γ, siendo dependiente de la fracción de EVs utilizada. Estos resultados evidencian que las EV-DC tienen un rol en la amplificación de los efectos de T3 informados por nuestro grupo: la activación de DCi y el inicio de las respuestas adaptativas Th1, Th17, citotóxica y proinflamatoria. En conjunto, los resultados de este trabajo de Tesis Doctoral sugieren una compleja red molecular que involucra a los esfingolípidos en la acción de T3 sobre las DC y a las EVs en la comunicación celular parácrina y endócrina de la señal generada. Estos nuevos conocimientos aportan bases moleculares y celulares para diseñar estrategias terapéuticas que permitan potenciar las características fenotípicas y funcionales de las DCs, células que por su potencial y plasticidad son la base de diferentes tipos de terapias desarrolladas -y en vías de desarrollo- involucradas en el tratamiento de patologías relacionadas a los sistemas inmune y endócrino.
The endocrine system is a complex communication network that regulates the homeostasis of the organism in conjunction with the immune and nervous systems. Thyroid Hormones (THs) are essential for the neuronal and somatic development of mammals and, in adulthood, control thermoregulation and the lipid, protein, and carbohydrate metabolisms. Despite significant advances in understanding the interaction between various hormones and the immune system, the role of THs in the initiation of adaptive immunity was uncertain until some years ago. In this regard, the laboratory where this Doctoral Thesis was developed provided the first evidence of the expression of TH receptors (TR) in bone marrow-derived dendritic cells (DCs) from mice, the main antigen-presenting cells (APCs) responsible for orchestrating the adaptive immune response. It was demonstrated that physiological levels of triiodothyronine (T3) increase the phenotypic markers of DC maturation: MHC-II, CD80, CD86, CD40; and promote the synthesis and secretion of activation markers such as cytokines interleukin (IL)-12, IL-6, IL-23, IL-1β, and TGF-β1. These effects manifest primarily through the β1 isoform of TR (TRβ1), predominantly located in the cytoplasm, dependent on the phosphorylation of Akt and the nuclear transcription factor NF-κB, and apparently by a mechanism that is independent of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Additionally, immature DCs (DCi) stimulated by T3 (DC-T3) increased the allostimulatory capacity of T lymphocytes (LT) in co-cultures, directing the adaptive immune response towards cytotoxic and pro-inflammatory T helper (Th)1 and Th17 profiles with increased secretion of cytokines IFN-ɣ and IL-17, reducing the population of regulatory T cells (Treg). On the other hand, sphingolipids are ubiquitous components of mammalian cell membranes. These lipids can be rapidly metabolized through the activation of enzymatic cascades. Their metabolites have been implicated in multiple immune events, aging, and tumor processes, among others. In particular, the axis formed by the enzyme sphingosine kinase 1 (SK1), sphingosine-1-phosphate (S1P), and its receptor (S1PR) have been proposed as mediators of pathophysiological signaling pathways. The action of S1P is carried out both as an intracellular messenger and also through G protein-coupled membrane receptors, explaining the complexity of its effects. S1P plays a modulatory role in the immune system, depending on the cell type and context. SK1 has been linked to the intracellular regulation of TNF-α and NF-κB dependent pathways. S1PRs are involved in the regulation of Akt, PKC, and STAT3, among other intracellular mediators. However, little is known about the roles of the SK1/S1P/S1PR axis in the effect of THs in the immune response. Additionally, it has been reported that extracellular vesicles (EVs), lipid nanovesicles released by all cells, carry nucleic acids, lipids, and proteins inside and possess various molecules on their surface. EVs have been postulated as important components of intercellular communication. In particular, EVs released by DCs (EV-DC) have MHC-II and co-stimulatory molecules, allowing them to efficiently perform antigen presentation and activate TL. EVs are involved in the initiation, maintenance, and regulation of the immune response. Numerous reports and clinical trials propose potential uses of EVs in precision medicine, such as in immunotherapies or as prognostic and/or predictive biomarkers of various pathological entities. The general objective of this Doctoral Thesis was to deepen the knowledge about the molecular and cellular mechanisms involved in the effects of T3 on DCs, and the adaptive immune response driven by these APCs. Specifically, this work was divided into two specific aims: 1- To study whether the sphingolipid pathway participates in the mechanism involved in the effects of T3 on DCs and the modulation of the immune response; and 2- To characterize and evaluate the functionality of EVs derived from DC-T3 on the innate and adaptive immune response. The results obtained in the first part of this Doctoral Thesis support the hypothesis that sphingolipids participate, at least in part, in the mechanism of DC activation after T3 exposure. In particular, the SK1/S1P/S1PR pathway mediates the phosphorylation of Akt at Ser473 induced by DC-T3, and regulates the production and secretion of IL-12. We also demonstrated that S1PR regulates the secretion of IL-6, but not SK. Regarding the role of sphingolipids in the activation of DC-T3 and the adaptive immune response, our results suggest that they do not appear to be involved in the mechanism responsible for splenocyte proliferation or the Th1 profile, at least under the conditions studied in this work. However, we demonstrated that the SK1/S1P/S1PR pathway in DC-T3 regulates the Th17 response. The results obtained in the second part of this Doctoral Thesis indicate that when DCs are exposed to T3, they produce EVs with biochemical and phenotypic characteristics in accordance with the established international standards. Additionally, they are involved in the paracrine communication between DCs, as they amplify the initial generated signal. In particular, we demonstrated that both EV-DC-T3 and EV-iDC have the functional capacity to activate in a paracrine mode syngeneic DCi with IL- 12p70 production. Furthermore, EVs from DC-T3 exposed to allogeneic splenocytes tend to increase the population of CD8+ TL (cytotoxic). Additionally, EV-DC-T3 modify the secretion of pro-inflammatory cytokines IL-17 and IFN-γ, depending on the EV fraction used. These results demonstrate that EV-DC plays a role in amplifying the effects of T3 reported by our group: the activation of DCi and the initiation of Th1, Th17, cytotoxic, and pro-inflammatory adaptive responses. Altogether, the results of this Doctoral Thesis work suggest a complex molecular network involving sphingolipids in the action of T3 on DC and EVs in the paracrine and endocrine cellular communication of the generated signal. These new insights provide molecular and cellular bases for designing therapeutic strategies that enhance the phenotypic and functional characteristics of DCs, cells that, due to their potential and plasticity, are the basis of various types of therapies developed -and under development- involved in the treatment of pathologies related to the immune and endocrine systems.
2026-07-31
Fil: Negretti Borga, Dana María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina