Estudios de eventos celulares y moleculares in vitro e in vivo asociados al proceso de exocitosis acrosomal de espermatozoides murinos

• Autores: La Spina, Florenza Antonella
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ropolo Alejandro; Buffone Mariano G.; Mendeluk, Gabriela; Cética, Pablo Daniel; Césari, Andreína
• Materia: Espermatozoide; Capacitación; Exocitosis acrosomal; Migración oviductal; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: La Spina, Florenza Antonella. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Los espermatozoides de mamífero necesitan experimentar, dentro del tracto reproductor femenino, una serie de cambios celulares y moleculares denominados en conjunto\ncapacitación para poder fecundar al ovocito. Estas modificaciones altamente reguladas\nprepara a los espermatozoides para realizar dos eventos fundamentales para la\nfecundación: la hiperactivación y la exocitosis acrosomal (EA). La EA es un proceso\nsecretorio único, e irreversible que es iniciado luego de la interacción de los\nespermatozoides con ciertos inductores fisiológicos presentes en el tracto reproductor\nfemenino.\nEn las últimas décadas, el dogma prevalente en el campo sostuvo que el espermatozoide\npara poder llevar a cabo la EA debía interaccionar directamente con la zona pelúcida (ZP)\ndel ovocito. Sin embargo, en los últimos años ha surgido nueva evidencia,\nfundamentalmente en el modelo murino, que contradice dicho paradigma. En virtud de\nque el conocimiento de este proceso fue obtenido de ensayos experimentales realizados\nin vitro, nos propusimos estudiar la EA con enfoques novedosos y originales que incluyen\nentre otras cosas, la posibilidad de observación dentro del tracto reproductor de la\nhembra. El objetivo central de nuestro trabajo fue estudiar la respuesta a los inductores\nfisiológicos de la EA in vitro y los sitios de ocurrencia de este proceso in vitro e in vivo en\nel modelo murino. Nosotros proponemos como hipótesis general que la estabilidad del\nacrosoma y los estímulos adecuados para inducir la EA están estrechamente regulados\npor la interacción del espermatozoide con el entorno fisiológico del oviducto.\nEn el presente trabajo utilizamos como principal modelo experimental, espermatozoides\ntransgénicos CAG/mt-DsRed2, Acr-EGFP para monitorear el estado acrosomal. La\nventaja de estos espermatozoides transgénicos es que cuando ocurre la EA, el contenido\nacrosomal se libera al medio y la marca fluorescente verde se pierde (ausencia de marca\nEGFP), pudiendo observar en tiempo real cuando está ocurriendo el proceso exocítico.\nNuestros experimentos reforzaron la hipótesis de otros grupos que sostienen que la ZP\ntiene la capacidad de inducir o acelerar la EA en condiciones in vitro, solo cuando es\nutilizada en su forma solubilizada. Asimismo, la progesterona, otro de los inductores\nfisiológicos ampliamente estudiado, es un débil estimulante de la EA en concentraciones\ncercanas a las observadas en el tracto reproductor femenino, siendo una molécula\nimportante pero no estrictamente necesaria para que ocurra la fertilización in vitro. En \nexperimentos utilizando un sistema de imágenes en tiempo real, se observó que el\ncomplejo de células de la granulosa que rodea al ovocito (cumulus oophorus, COC) no\nsería el sitio de ocurrencia de la exocitosis acrosomal in vitro. Teniendo en cuenta todo\nesto, nos propusimos evaluar los efectos al disminuir la concentración de progesterona\nutilizando trilostano, un inhibidor competitivo de la proteína 3-? deshidrogenasa (3?-HSD),\nla cual es esencial para la síntesis de este esteroide. En ensayos donde se realizó una\ndisminución de la concentración de progesterona en el cumulus oophorus, no se observó\nun efecto sobre la tasa de fertilización in vitro, aunque otros factores propios presentes en\ndicho complejo de células del cumulus-ovocito estarían participando en generar una\nmayor eficiencia en la fertilización. En estudios in vivo, realizados mediante el apareo de\nratones transgénicos con hembras wild-type, se concluyó que la EA es inducida dentro del\ntracto femenino en los segmentos altos del oviducto (istmo alto), previo a la interacción\ncon la ZP y el cumulus oophorus por factores presentes en el mismo que aún no han sido\nidentificados. Mientras que aquellos espermatozoides que logran migrar a el ámpula se\nencontraron en su amplia mayoría ya reaccionados.\nCon el objetivo de estudiar más profundamente la función de esta hormona en el tracto\nfemenino, en particular, como principal molécula capaz de iniciar la EA, se realizaron\nestudios in vivo donde se logró disminuir su concentración presente en los COC utilizando\nherramientas farmacológicas. La disminución significativa en la concentración de este\nesteroide generada por la administración de trilostano a ratones hembras al momento de\nla ovulación, produjo una menor tasa de fertilización in vivo. Esta disminución sería\noriginada principalmente por un menor número de espermatozoides con capacidad de\nmigrar a través del oviducto y no por una imposibilidad de realizar la EA, ya que los\nespermatozoides observados en los segmentos altos del oviducto, no presentaban sus\nacrosomas. La coadministración de progesterona junto con el inhibidor trilostano pudo\nrecuperar parcialmente los efectos observados con el inhibidor.\nComo conclusión, en este trabajo de tesis demostramos por primera vez que, en el\nmodelo murino, la mayoría de los espermatozoides en su entorno fisiológico realizan la\nEA antes de entrar en el ámpula e interaccionar con los ovocitos. El o los inductores\nresponsables de iniciar la EA en este sitio del tracto reproductor femenino deberán ser\nidentificados en futuras experimentaciones.
Ciencias Biológicas
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica