Mecanismos involucrados en la resistencia hormonal de carcinomas mamarios humanos: participación de las isoformas del factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2)

• Autores: Figueroa, Virginia
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ropolo, Alejandro; Lamb, Caroline A.; Davio, Carlos; Langle, Yanina; Rossi, Mario
• Materia: Cáncer de mama; FGF2; PR; AR; Vía de Wnt; Progresión tumoral; Breast cancer; FGF2; PR; AR; Wnt pathway; Tumor progression; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Seventy-five per cent of mammary carcinomas express estrogen receptor alpha (ER) and progesterone receptors (PR) and are susceptible to endocrine therapy. However, over time, many of these patients develop resistance to therapy. In our laboratory, using murine and human mammary carcinoma models, we have shown that tumors that respond to therapy with the antiprogestin mifepristone (MFP) have higher expression of PR isoform A (PRA) than isoform B (PRB), while those with higher levels of PRB than PRA are MFP-resistant tumors.\nVarious hypotheses have been proposed to explain the mechanisms leading to endocrine resistance, including constitutive activation of signal transduction pathways. The FGF2/FGFR pathway involves four receptors (FGFR1-4) and five FGF2 isoforms with different molecular weights: the 18-kDa isoform or LMW-FGF2, and the high molecular weight (HMW)-FGF2 of 22-, 22,5, 24 and 34 kDa. In previous studies we demonstrated that, in MFP-responsive tumors, FGFR2 activated by stromal FGF2 participates in tumor growth through PR activation. Likewise, in murine and human experimental models, we demonstrated that endocrine-resistant mammary carcinomas express higher levels of intracellular HMW-FGF2 than responsive variants and that HMW-FGF2 overexpression induces endocrine resistance and an increase in metastatic spread. Although it has been shown that the FGF2/FGFR pathway is deregulated in numerous neoplasms and developmental pathologies, in breast cancer, many questions remain to be answered regarding the role of FGF2 isoforms and the mechanisms involved in the acquisition of FGF2-induced endocrine resistance. Moreover, the studies that report the expression of total FGF2 in samples from patients with breast cancer are still controversial, and there are no studies that investigate whether there is an association between the expression of FGF2 isoforms and disease prognosis.\nThus, our working hypothesis is that in the T47D cell line, the overexpression of LMW- or HMW-FGF2 isoforms differentially regulates the activation of signaling pathways, which include crosstalk with hormone receptor pathways, and that favors tumor growth and progression. Therefore, our main aim was to evaluate the role of the different FGF2 isoforms in luminal breast cancer progression and the association with hormone receptor pathways.\nIn the first place, we used the cell lines already available in our laboratory, T47D-YA-p6NST50, -YA-18 and -YA-22,5, which express only PRA, and also express an empty plasmid, or plasmids containing the 18 kDa or the 22,5 kDa isoforms of FGF2. We performed RNA-seq assays to identify differentially expressed transcripts in the presence of one or another FGF2 isoform to find candidates involved in tumor progression induced by these isoforms. We observed that, in both cell lines, FGF2 overexpression induces the deregulation of different pathways, like the Wnt pathway and the expression of hormone receptors, among others, that could affect tumor progression. Although both -LMW and -HMW overexpression induce deregulation of the Wnt pathway, we observed a differential deregulation in WNT ligands. Furthermore, we determined that both FGF2 variants induce a decrease in ESR1 and PGR along with an increase in AR transcription levels.\nWe then developed a model of FGF2 isoform overexpression that would better reflect what occurs in breast cancer patients that carry PR+ tumors which normally express both PR isoforms. Therefore, we stably transfected the T47D cell line with the plasmids containing the 18 kDa or 22 kDa FGF2-isoforms. Upon characterization we observed that, as in the T47D-YA model, LMW- and HMW-FGF2-overexpression favors tumor progression determined as an increase in tumor growth, metastatic dissemination, and the acquisition of antiprogestin resistance. Next, we performed Western blot and RT-qPCR assays to determine hormone receptor expression and we found that the overexpression of both FGF2 isoforms, in the T47D and in the T47D-YA cell lines, induces the decrease of ER and PR and, in the case of the T47D-18 and -22 lines, this decrease in PR was more pronounced for PRA than PRB resulting in a low PRA/PRB ratio, which is consistent with an endocrine resistant phenotype, according to previous results from our lab. These results would allow to explain the acquisition of MFP resistance investigated in depth in other previous studies from our laboratory. That is, the increase in total FGF2 could be favoring the PRB phenotype and, therefore, play an important role in antiprogestin resistance. Furthermore, we determined that, in the T47D model, only HMW-FGF2, and not LMW-FGF2, induced an increase in AR expression. The differences between the cell lines that overexpress one or another FGF2 isoform were also reflected in a differential response to agonists or antagonists of ER, PR, AR and inhibitors of the Wnt pathway, as well as in the activation of the AKT pathway, which reinforces the idea that both isoforms would have differential roles.\nNext, we investigated the cross-regulation of FGF2, PR, ER, and AR expression. To this end, we used conditioned media from cell lines that overexpress FGF2 isoforms to investigate whether they were capable of modulating ER and PR expression. We observed that the decrease in ER observed in both T47D-18 and -22 would be an indirect effect of FGF2 action, which would induce the secretion of soluble factors such as WNT4, which, in turn, trigger other signals that impact ER expression. On the other hand, we determined that FGF2 induces PR decrease through a different and ER-independent mechanism.\nMoreover, to determine whether PRB or AR can regulate the FGF2 expression, we transfected the T47D-Y cell line, which does not express PR, and the T47D-YA with a constitutive expression plasmid of PRB and found an increase in FGF2 expression. Then, we designed a reporter plasmid containing the FGF2 promoter coupled to the luciferase gene, transfected the T47D-YB cell line, and evaluated luciferase expression in the presence of progestogens, androgens, and antiandrogens. We observed that progestins repressed FGF2 promoter activity, which is consistent with the inhibitory effect of progestins in a PRB context. In addition, we found an effect in the same direction when treating with an antiandrogen, which suggests that both PRB and AR would be basally active in a ligand-independent manner and inducing FGF2.\nThe fact that the T47D-22 cell line has a deregulated Wnt pathway and an increased AR expression positioned it for treatment with inhibitors of both pathways. We carried out in vitro and in vivo assays and found that this tumor is sensitive to treatment with both inhibitors. In addition, we determined that combined treatment with these drugs decreases not only tumor growth but also the dissemination and growth of metastatic foci.\nFinally, to study whether there is a correlation between the nuclear expression of FGF2 and AR, we evaluated the expression and localization of both proteins in breast cancer samples from the Magdalena V. de Martínez hospital, focusing on luminal tumors. We observed that patients with higher expression of nuclear FGF2 also express a higher percentage of AR. When we classified the samples by tumor subtype, we observed a similar association in HER2+ tumors, and a trend in the same direction is even distinguished in the ER+PR- subgroup, which is the subgroup that most resembles our experimental model. These results suggest that there is an association between the AR and FGF2 pathways.\nTogether, in this work we demonstrate that the LMW- and HMW-FGF2 isoforms have differential roles and favor tumor progression in a luminal model of breast cancer. Our results suggest that ligand-independent activation of PRB or AR would induce the expression of FGF2, which in turn would increase the secretion of Wnt ligands, favoring tumor progression.\nWe propose that the subgroup of ER+PR-AR+ tumors with nuclear expression of FGF2 could benefit from an antiandrogenic therapy combined with inhibitors of the Wnt pathway. This therapy could even benefit patients with advanced breast cancer.
Fil: Figueroa, Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
El 75% de los carcinomas mamarios expresa receptores de estrógenos alfa (ER) y de progesterona (PR) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, muchas de estas pacientes desarrollan resistencia a la terapia. En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del PR (PRA) que de la isoforma B (PRB). A su vez, los tumores resistentes, se caracterizan por manifestar la relación inversa (PRB>PRA).\nSe han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22, 22,5, 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los PR. Asimismo, en modelos experimentales murinos y humanos demostramos, que los carcinomas mamarios resistentes endocrinos expresan mayores niveles de HMW-FGF2 intracelular que las variantes sensibles y que la sobreexpresión de HMW-FGF2 induce resistencia al tratamiento endocrino y un aumento de la diseminación metastásica. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en cáncer de mama, aún quedan muchos interrogantes por responder respecto del rol de las isoformas de FGF2 y los mecanismos involucrados en la adquisición de la resistencia endocrina. Asimismo, los estudios que informan la expresión de FGF2 total en muestras de pacientes con cáncer de mama es aún controvertida y, no hay trabajos que investiguen si hay una asociación entre la expresión de isoformas de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad.\nEn base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que en la línea celular T47D la sobreexpresión de isoformas LMW- o HMW-FGF2 regulan diferencialmente la activación de vías de señalización, que incluyen un entrecruzamiento con vías de receptores hormonales, y que favorecen el crecimiento y la progresión tumoral. Por lo tanto, nuestro objetivo general fue evaluar el rol de las distintas isoformas de FGF2 en la progresión del cáncer de mama luminal y su interrelación con vías de receptores hormonales.\nEn primer lugar, utilizamos las líneas celulares ya disponibles en el laboratorio, T47D-YA-p6NST50, -YA-18 e -YA-22,5, que expresan sólo PRA, y expresan, además, un plásmido vacío, la isoforma de 18 kDa de FGF2 o la isoforma de 22,5 kDa, respectivamente. Realizamos ensayos de RNA-seq para identificar transcriptos diferencialmente expresados en presencia de una u otra isoforma de FGF2 que nos permitan encontrar candidatos involucrados en la progresión tumoral inducida por dichas isoformas. Observamos que, en ambas líneas celulares, la sobreexpresión de FGF2 induce la desregulación de distintas vías que podrían afectar la progresión tumoral, entre otras, la vía de Wnt y la expresión de receptores hormonales. Si bien, tanto la sobreexpresión de -LMW como de -HMW inducen la desregulación de la vía de Wnt, observamos una desregulación diferencial en los ligandos de la vía. Además, determinamos que ambas variantes de FGF2 inducen una disminución en los niveles de ESR1 y PGR junto con un aumento en AR.\nLuego, desarrollamos un modelo de sobreexpresión de isoformas de FGF2 que reflejara de mejor manera los tumores PR+ hallados en la clínica que normalmente expresan ambas isoformas de PR. Por lo tanto, utilizamos la línea celular T47D, sobreexpresamos las isoformas de 18 kDa y de 22 kDa de manera estable y las caracterizamos. Observamos que, al igual que en el modelo T47D-YA, la sobrexpresión de LMW- y HMW-FGF2 favorece la progresión tumoral determinada como un aumento en el crecimiento tumoral, la diseminación metastásica y la adquisición de resistencia a antiprogestágenos. Asimismo, realizamos ensayos de Western blot y RT-qPCR para determinar la expresión de receptores hormonales y observamos que la sobreexpresión de ambas isoformas de FGF2 tanto en la línea T47D, como en la línea T47D-YA, induce la disminución de ER y PR y, en el caso de la línea T47D-18 y -22, esta disminución en PR altera la proporción de PRA/PRB, prevaleciendo la expresión de PRB. Estos resultados permitirían explicar la adquisición de resistencia a MFP investigada en profundidad en otros trabajos previos del laboratorio. Es decir, el aumento en FGF2 total podría estar favoreciendo el fenotipo PRB y, por lo tanto, cumplir un rol importante en la resistencia a antiprogestágenos. Además, determinamos que, en el modelo T47D, sólo HMW-FGF2 y no LMW-FGF2, induce un aumento en la expresión de AR. Las diferencias entre las líneas que sobreexpresan una u otra isoforma de FGF2 también se reflejaron en una respuesta diferencial a agonistas o antagonistas de ER, PR, AR e inhibidores de la vía de Wnt, así como también en la activación de la vía de AKT, lo que refuerza la idea de que ambas isoformas tendrían roles diferenciales.\nA continuación, investigamos la regulación de la expresión entre FGF2, PR, ER y AR. Para ello, utilizamos medios condicionados de las líneas celulares que sobreexpresan las isoformas de FGF2 para investigar si eran capaces de modular la expresión de ER y PR. Observamos que la disminución de ER observada tanto en T47D-18 como en -22, sería un efecto indirecto de la acción de FGF2, que induciría la secreción de factores solubles como WNT4, que gatillan otras señales que impactan en la expresión de ER. Por otro lado, determinamos que el FGF2 induce la disminución de PR mediante un mecanismo diferente e independiente al de ER.\nAsimismo, con el objetivo de determinar si PRB o AR son capaces de regular la expresión de FGF2, transfectamos la línea celular T47D-Y, que no expresa PR, y la T47D-YA con un plásmido de expresión constitutiva de PRB y observamos un aumento en la expresión de FGF2. Luego, diseñamos un plásmido reportero conteniendo el promotor de FGF2 acoplado al gen de luciferasa, transfectamos la línea celular T47D-YB, y evaluamos la expresión de luciferasa en presencia de progestágenos, andrógenos y antiandrógenos. Observamos que los progestágenos reprimieron la actividad del promotor de FGF2, lo cual coincide con el efecto inhibitorio de los progestágenos en un contexto PRB. Además, habría un efecto en el mismo sentido al tratar con un antiandrógeno, lo que sugiere que tanto PRB como AR estarían basalmente activos de manera ligando independiente e induciendo FGF2.\nEl hecho de que la línea celular T47D-22 presenta una vía de Wnt desregulado y mayor expresión de AR la posicionaba para el tratamiento con inhibidores de ambas vías. Realizamos ensayos in vitro e in vivo y observamos que es sensible al tratamiento con dichos inhibidores. Además, determinamos que el tratamiento combinado con estos fármacos disminuye no sólo el crecimiento tumoral sino también la diseminación y crecimiento de los focos metastásicos.\nFinalmente, con el objetivo de estudiar si existe una correlación entre la expresión nuclear de FGF2 y AR, evaluamos la expresión y localización de ambas proteínas en muestras de cáncer de mama provenientes del hospital Magdalena V. de Martínez, focalizando en tumores luminales. Observamos que los pacientes con mayor expresión de FGF2 nuclear expresan también un mayor porcentaje de AR. Cuando clasificamos por subtipo tumoral, observamos una asociación similar en los tumores HER2, e incluso también se distingue una tendencia en el mismo sentido en el subgrupo ER+PR-, que es el subgrupo que más se asemeja a nuestro modelo experimental. Estos resultados sugieren que hay una interrelación entre las vías de AR y FGF2.\nEn conjunto, en este trabajo demostramos que las isoformas LMW- y HMW-FGF2 poseen roles diferenciales y favorecen la progresión tumoral en un modelo luminal de cáncer de mama. Nuestros resultados sugieren que, la activación ligando independiente de PRB o AR, inducirían la expresión de FGF2, que a su vez aumentaría la secreción de ligandos Wnt, favoreciendo la progresión tumoral.\nProponemos que el subgrupo de tumores ER+PR-AR+ con expresión nuclear de FGF2 podría beneficiarse con una terapia antiandrogénica combinada con inhibidores de la vía de Wnt. Esta terapia podría beneficiar incluso a pacientes con cáncer de mama avanzado.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas