Vesículas extracelulares y Transferencia Horizontal Genética en la adaptación hacia la extrema droga resistencia de E. coli en el marco "Una Salud"

• Autores: Carrera Páez, Laura Camila
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Quiroga, María Paula; Gutkind, Gabriel; Centrón, Daniela; Power, Pablo; López, Nancy; Pistorio, Mariano
• Materia: Vesículas extracelulares; Conjugación; Vesiducción; Transformación; Resistencia a antibióticos; E. coli; Plásmidos; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

One of the major challenges in addressing multidrug resistance is understanding the true burden of AMR. This is especially true where surveillance is minimal and data is scarce, such as in environmental ecosystems. In the context of One Health, there is evidence that antimicrobial resistance genes (ARG) in environmental bacteria can be rapidly acquired by human- and animal-associated pathogens and vice versa. Therefore, the transmission mechanisms of ARG in the different known reservoirs need to be characterized in detail. One of these mechanisms is the Horizontal genetic Transfer (HGT), which is mediated by canonical processes such as conjugation, transformation and transduction, and by non-canonical processes such as the novel mechanism known as vesiduction, which is generated by the release of EV.\nThree E. coli isolates of different origin and epidemiologic behavior were used as biological models in this study. The first is an isolate of environmental origin, the E. coli 4IgSN1 strain, being the other two clinical isolates, one a sporadic clone represented by E. coli M19736 ST615 strain, and the second a clone with pandemic behavior represented by E. coli SM5 ST131 strain. We performed genomic analysis of our three models in search of determinants of AMR. The genome of the E. coli 4IgSN1 strain was sequenced and its chromosome contains a genetic platform with a deleted intI1 gene, encoding a type 1 integrase, followed by the dfrB2 gene cassette. Both genes are inserted into the xerD gene, a site-specific tyrosine recombinase. Genomic analysis of biological model E. coli M19736 revealed that this strain carries chromosomal AMR determinants including fosL1, tet(B) and mutations at the quinolone resistance determining region. The presence of 3 plasmids was also detected, two of which harbor ARG. The first plasmid pM19736-MCR-1, previously reported, harbors the mcr-1 gene, while the second plasmid pM19736-IncFIB_IncFII harbors aph(6)-Id, aph(3'')-Ib, blaTEM-1B, floR and sul2 genes. The genome of E. coli SM5 strain has been analyzed in previous studies from our laboratory. This strain harbors the plasmid pseudomolecule pDCAG1-CTX-M-15. Several GRAs were found such as: tet(B), catB3, dfrA8, sul2, blaCTX-M-15, blaTEM-1B, blaOXA-1, aac(6?)-Ib-cr, aph(6)-Id and aph(3??)-Ib.\nOn the other hand, we have confirmed the ability of the three biological models of E. coli to receive clinically crucial ARG carried by MDR plasmids by transformation or conjugation using as donors the plasmids pM19736-MCR-1 (>63230, Incl2) carrying the mcr-1 gene, pDCAG1-CTX-M-15 (>112,000 bp, IncFII) carrying the blaCTX-M-15 gene, pDCCK1-KPC (>77,218 bp, IncM1) which contains the blaKPC-2 gene, pDCVA3-NDM -5 (>534,520 bp, IncFII) which contains the blaCTX-M-15 and blaNDM-5 genes, pDCASG-NDM-1 (137,269 bp, IncC) harboring the blaNDM-1 gene, pDCPR3-VIM-2 (pDCPR3-VIM-2) harboring the blaVIM-2 gene, and non-mobilized pAO1Bc (5,877 bp, p15A) harboring the aadB gene cassette. PCR, MIC, antibiogram and phenotypic detection of ?-lactamases were used to verify the acquisition of ARG. The ability of each transconjugant or transformant to maintain ARG over time without antibiotic pressure was then evaluated. Environmental isolate E. coli 4IgSN1 and sporadic clone E. coli M19736 were able to receive and maintain plasmids pDCAG1-CTX-M-15, pDCVA3-NDM-5 and pDCASG-NDM-1 over time. On the other hand, the three biological models E. coli 4IgSN1, E. coli M19736 and E. coli SM5 were able to acquire the plasmids pDCCK1-KPC and pAO1Bc, but could not maintain them over time. In sequential experiments, the E. coli M19736 strain acquired multiple plasmids giving rise to strains that we refer as evolved strains MDR and XDR-E. coli M19736 strains. Evolved MDR-E. coli strain M19736 sequentially acquired the blaCTX-M-15 and blaNDM-1 genes. Over time, it maintained ARG of 41.1% and 91.1%, during 10 days without antibiotic pressure, respectively. When this strain sequentially acquired the aadB gene (XDR-E. coli M19736 strain), the maintenance pattern changed, to 100% loss for blaCTX-M-15 and aadB genes, 98.9% maintenance of blaNDM-1 gene, and 100% maintenance of mcr-1 gene. Interestingly, evolved MDR and XDR-E. coli M19736 simultaneously disseminated the acquired conjugative plasmids pDCASG-NDM-1 and pDCAG1-CTX-M-15 as well as the native pMCR1-M19736 with different combinations of co-infection, although the selection was ceftazidime in all cases.\nFinally, we characterized the OMV of the E. coli strains carrying the MDR plasmids used as donors (E. coli M19736, E. coli SM5, K. pneumoniae HA7pKpn, K. pneumoniae HA31, S. marcescens SM938 and P. aeruginosa PAE981) in our conjugation experiments. It was possible to detect by PCR the blaCTX-M-15 genes in OMV of E. coli SM5, K. pneumoniae HA31 and evolved XDR-E. coli M19736; the blaNDM-1 gene in OMV of S. marcescens SM938; the blaNDM-5 gene in OMV of K. pneumoniae HA31 and the mcr-1 gene in OMV of E. coli M19736. Interestingly, OMV from evolved XDR-E. coli M19736 harbored blaCTX-M-15 though the plasmid pDCAG1-CTX-M-15 was previously lost as shown by WGS and experiments along time. Furthermore, by LC/MS-MS we could detect MCR-1 protein in E. coli M19736 OMV; AAC (6'), ?-lactamases TEM and CTX-M-1 and MBL NDM in K. pneumoniae HA31 OMV; KPC carbapenemase in K. pneumoniae HA7pKpn OMV.\nTogether, these results evidenced the genetic plasticity of E. coli and emphasize the relevance of focusing studies on environmental and sporadic clones´ models to evaluate adaptation to extreme drug resistance. Based on this, environmental strains and sporadic clones could play a crucial role in a clinical context in the maintenance and transmission of AMR, either by adapting to different selection pressures and at the same time spreading plasmids to other bacteria, ensuring an important link in the chain of events that leads bacteria to resist in the nosocomial niche. Finally, we demonstrate how OMV are active reservoirs of AMR determinants, having enormous potential to disseminate them.
Fil: Carrera Páez, Laura Camila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Uno de los principales desafíos para abordar la problemática del aumento creciente de la multirresistencia a los antibióticos, es comprender la verdadera carga de la RAM, especialmente en lugares donde la vigilancia es escasa o inexistente tal como sucede en ecosistemas ambientales. En el marco conceptual de ?Una Salud?, se sugiere que los GRA presentes en cepas ambientales pueden ser rápidamente adquiridos por bacterias patógenas asociadas a humanos y/o animales y viceversa. Por lo tanto, es necesario caracterizar en profundidad los mecanismos de transmisión de la RAM en los diferentes reservorios conocidos hasta hoy. Estos mecanismos incluyen la THG mediada por procesos canónicos (ej. conjugación, transformación) así como no canónicos, siendo el novedoso mecanismo conocido como vesiducción, que se produce por la liberación de VE, aún muy poco estudiado.\nSe utilizó como modelo biológico tres aislamientos de E. coli de diferente origen, diferentes secuenciotipos, y con comportamiento epidemiológico diferente. El primero es un aislamiento de origen ambiental, la cepa E. coli 4IgSN1 ST10, siendo los otros dos aislamientos clínicos, la cepa E. coli M19736 perteneciente al clon esporádico ST615, y la cepa E. coli SM5 perteneciente al clon con comportamiento pandémico ST131. Realizamos el análisis genómico de nuestros tres modelos en busca de determinantes de la RAM. Se logró cerrar por MySeq y PacBio el genoma de la cepa E. coli 4IgSN1 ST10; esta cepa posee en su cromosoma una plataforma genética con un gen intI1 deletado que codifica para una integrasa de tipo 1, seguido del gen cassette dfrB2; ambos genes están insertos en el gen xerD que es una tirosina recombinasa sitio-especifica. El análisis del genoma de la cepa E. coli M19736 mostró que tiene en su cromosoma determinantes de la RAM que incluyen los genes fosL1, tet(B) y mutaciones en la región determinante de resistencia a quinolonas. También fue posible detectar la presencia de 3 plásmidos, dos de los cuales albergan GRA en su interior. El primer plásmido pM19736-MCR-1, previamente reportado, alberga el gen mcr-1, mientras que el segundo plásmido pM19736-IncFIB_IncFII alberga los GRA aph(6)-Id, aph(3'')-Ib, blaTEM-1B, floR y sul2. El genoma de la cepa E. coli SM5 fue objeto de análisis en estudios previos de nuestro laboratorio. Esta cepa alberga la pseudomolécula plasmídica pDCAG1-CTX-M-15 en el cual se localizan, entre otros GRA, los genes blaCTX-M-15, blaTEM-1B, blaOXA-1, y aac(6?)-Ib-cr.\nPor otra parte, confirmamos la capacidad de los tres modelos biológicos de E. coli para recibir GRA de importancia clínica albergados en plásmidos MDR mediante transformación y conjugación, utilizando como donantes los plásmidos pM19736-MCR-1 (>63230, Incl2, gen mcr-1), pDCAG1-CTX-M-15, (>112.000 pb, IncFII, gen blaCTX-M-15), pDCCK1-KPC (>77.218 pb, IncM1, gen blaKPC-2), pDCVA3-NDM-5 (>534,520 pb, IncFII, genes blaCTX-M-15 y blaNDM-5), pDCASG-NDM-1 (137,269 pb, IncC, gen blaNDM-1), pDCPR3-VIM-2 (>331,93 pb, gen blaVIM-2) y pAO1Bc no movilizable (5,877 pb, p15A, gen cassette aadB). La adquisición de GRA se verificó mediante PCR, CIM, antibiograma y detección fenotípica de ?-lactamasas. La cepa E. coli 4IgSN1 y E. coli M19736 mantuvieron sin presión de antibióticos a lo largo del tiempo los plásmidos pDCAG1-CTX-M-15, pDCVA3-NDM-5 y pDCASG-NDM-1, mientras que la cepa E. coli SM5 no fue capaz de adquirir los plásmidos pDCVA3-NDM-5 y pDCASG-NDM-1. Además, los tres modelos biológicos E. coli 4IgSN1, E. coli M19736 y E. coli SM5, adquirieron los plásmidos pDCCK1-KPC y pAO1Bc, pero no pudieron mantenerlos a lo largo del tiempo. En experimentos secuenciales, la cepa E. coli M19736 albergó múltiples plásmidos en simultáneo. La primera cepa evolucionada MDR-E. coli M19736 adquirió secuencialmente los genes blaCTX-M-15 y blaNDM-1, manteniendo durante 10 días sin presión de selección a los GRA en un 41,1% y 91,1%, respectivamente. Cuando la cepa evolucionada MDR-E. coli M19736 adquirió secuencialmente el gen aadB, dando lugar a la cepa evolucionada XDR-E. coli M19736, se encontró una pérdida del 100% para los genes blaCTX-M-15 y aadB y un mantenimiento de ~100% para los genes blaNDM-1 y mcr-1. Interesantemente, las cepas evolucionadas MDR y XDR-E. coli M19736 diseminaron simultáneamente los plásmidos adquiridos pDCASG-NDM-1 y pDCAG1-CTX-M-15 así como el plásmido nativo pMCR1-M19736 en diferentes combinaciones de co-infección, aunque la selección fue ceftazidima en todos los casos.\nFinalmente, caracterizamos las VME de las cepas portadoras de los plásmidos MDR usadas como dadoras (E. coli M19736, E. coli SM5, K. pneumoniae HA7pKpn, K. pneumoniae HA31, S. marcescens SM938 y P. aeruginosa PAE981) de nuestros experimentos de conjugación. Fue posible detectar por PCR el gen blaCTX-M-15 en las VME de E. coli SM5; K. pneumoniae HA31 y en la cepa evolucionada XDR-E. coli M19736; el gen blaNDM-1 en las VME de S. marcescens SM938; el gen blaNDM-5 en las VME de K. pneumoniae HA31 y el gen mcr-1 en las VME de E. coli M19736. De relevancia para los mecanismos de la THG y la RAM, las VME de la cepa evolucionada XDR-E. coli M19736 albergaban el gen blaCTX-M-15, aunque el plásmido pDCAG1-CTX-M-15 ya había sido perdido, como lo demostraron los experimentos a lo largo del tiempo y la secuenciación del genoma completo. Adicionalmente, por LC/MS-MS pudimos detectar la proteína MCR-1 en las VME de E. coli M19736; la AAC (6´), las ?-lactamasas TEM y CTX-M-1 y la MBL NDM en las VME de K. pneumoniae HA31; la carbapenemasa KPC en las VME de K. pneumoniae HA7pKpn y la MBL NDM en las VME de S. marcescens SM938.\nEn conjunto, estos resultados evidenciaron la plasticidad genética de E. coli y enfatizan la relevancia de enfocar estudios en modelos ambientales y de clones esporádicos para evaluar la trayectoria de los GRA que colaboran con la adaptación de las cepas hacia la extrema droga resistencia. Las cepas ambientales y los clones esporádicos podrían desempeñar un papel crucial en el mantenimiento y la transmisión de la RAM, ya sea teniendo una gran plasticidad para adaptarse a diferentes presiones de selección y al mismo tiempo propagando plásmidos a otras bacterias, lo cual pone en evidencia un eslabón importante en la cadena de eventos que lleva a las bacterias a resistir en el nicho nosocomial. Finalmente, demostramos como las VME son reservorios activos de determinantes de la RAM, teniendo un potencial enorme para diseminarlos.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas