Modulación de genes endógenos relacionados al trofoectodermo mediante el sistema CRISPR/dCas9 en embriones bovinos

• Autores: Alberio, Virgilia
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Salamone, Daniel Felipe
• Materia: Embrión; FIV; Trofoectodermo; CRISPR-on; dCas9VP160; dCas9p3; Embryo; IVF; Trophoectoderm; CRISPR-on; dCas9VP160; dCas9p300; Bovinos; Fecundación in vitro; Genética; ADN; Ciencias Veterinarias
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Placental defects are common in bovine embryos produced by assisted reproductive techniques. In this species, most embryonic losses occur in the second week of\ngestation, when differentiation towards the first three lineages begins. Therefore, the regulation processes of cell fate, the embryo morphokinetic development and the\nmaintenance of genomic stability are critical elements in the acquisition of competence during development. The work carried out in this thesis aimed to induce trophectodermal cell differentiation in\nin vitro fertilized embryos, activating different genes and two different CRISPR/dCas9\nsystems. This strategy allows studying and understanding of the regulatory mechanisms\nthat occur during embryonic differentiation. It could also be used to remedy failures in the placental development of embryos produced by other reproductive biotechnologies.\nInitially, we sought to study the effect of simultaneous endogenous activation of TFAP2C and SMARCA4 genes using mRNA of the CRISPR/dCas9VP160 system. This was\nthought to direct the differentiation towards the trophectoderm in the early stages of bovine preimplantation embryos produced in vitro. In our hands, the microinjection of\nmRNA from the CRISPR/dCas9VP160 system was effective in modulating the\nsimultaneous induction of TFAP2C and SMARCA4 expression and genes downstream of these, with effective action more extended in time, compared to individual gene\nactivation. This effect also showed an increased number of trophectoderm cells, with a possible positive effect on the implantation rate and subsequent development of the\nembryos to term, if they were transferred.\nNext, we seek to analyze the activating effect of the CRISPR/dCas9p300 system on CDX2 and GATA3 in bovine embryos, to determine if it is a powerful model for use in the\nstudy of mechanisms related to lineage differentiation. The change in the activation\nsystem was aimed at going from CRISPR/dCas9VP160, whose main function is to recruit transcription factors, to CRISPR/dCas9p300 which acetylates promoter regions to activate genes, which is more powerful due to its direct action. In addition, since the\ntarget genes are expressed in more advanced stages of bovine preimplantation\ndevelopment, microinjection of circular DNA with the CRISPR/dCas9p300 system was performed, due to its greater stability. According to our results, a priori, the\nCRISPR/dCas9p300 system was not effective in modulating the endogenous expression of the CDX2 and GATA3 genes, due to the sequestration of the protein in the cytoplasm of the embryonic blastomeres.\nFinally, we sought to evaluate the effect of the endogenous activation of CDX2 and GATA3 in advanced stages of bovine preimplantation embryonic development, using\ncircular DNA of the CRISPR/dCas9VP160 system. With this new strategy, our results\ndemonstrated that using DNA from the CRISPR/dCas9VP160 system effectively\nmodulates the expression of the CDX2 and GATA3 genes, at least until day 4 of\nembryonic development. Activation of CDX2 gene expression induced the expression of genes upstream, related to the trophoblastic lineage, such as TFAP2C and SMARCA4,\nindicating a possible regulation associated with the trophoblastic lineage. In addition, GATA3 activation-induced gene expression from the trophectodermal lineage, such as CDX2. The dCas9VP160 protein was localized to the embryonic nucleus, as expected\nfor its function, although it did not affect the trophectoderm cell number.\nIn the three chapters of this thesis, the embryo quality parameters did not show\ndetrimental effects compared to the IVF control due to the microinjection technique itself or by introduction of the CRISPR/dCas9 system in the zygote. These results present the CRISPR/dCas9 system as a very useful strategy to correct\naberrant gene expression or to increase the number of trophectoderm cells of in vitroproduced embryos, thus impacting on the implantation rates and the production of\nhealthy offspring.
Fil: Alberio, Virgilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
Los defectos placentarios son comunes en embriones bovinos producidos por\ntécnicas de reproducción asistida. En esta especie, la mayoría de las pérdidas\nembrionarias ocurren en la segunda semana de gestación, en el momento del inicio de la diferenciación hacia los tres primeros linajes. Por lo tanto, los procesos de regulación\ndel destino celular, el desarrollo morfocinético del embrión y el mantenimiento de la estabilidad genómica resultan elementos críticos en la adquisición de competencias\ndurante el desarrollo.\nEl objetivo del trabajo realizado en esta tesis fue inducir la diferenciación a células trofoectodérmicas en embriones bovinos preimplantatorios producidos por fecundación\nin vitro, activando distintos genes y dos sistemas diferentes de RISPR/dCas9. El uso de esta estrategia no solo permite el estudio y la comprensión de los mecanismos de\nregulación que suceden durante la diferenciación embrionaria, sino que también podría\nser empleada para remediar fallas en el desarrollo placentario de embriones producidos por otras biotecnologías reproductivas.\nInicialmente, se buscó estudiar el efecto de la activación endógena simultánea de\nlos genes TFAP2C y SMARCA4, utilizando ARNm del sistema CRISPR/dCas9VP160,\npara dirigir la diferenciación hacia el trofoectodermo en estadios tempranos de\nembriones preimplantatorios bovinos producidos in vitro. En nuestras manos, la\nmicroinyección de ARNm del sistema CRISPR/dCas9VP160 resultó efectivo para\nmodular la expresión de los genes TFAP2C y SMARCA4 en simultáneo y genes río\ndebajo de estos, con acción efectiva más extendida en el tiempo, respecto de la\nactivación génica individual. Este efecto mostró, además, un mayor número de células\ndel trofectodermo, con un posible efecto positivo en la tasa de implantación y posterior desarrollo a término de los embriones, en caso de ser transferidos.\nA continuación, buscamos analizar el efecto activador del sistema\nCRISPR/dCas9p300 sobre los genes CDX2 y GATA3 en embriones preimplantatorios\nbovinos, para determinar si es un modelo potente para su uso en el estudio de\nmecanismos relacionados a la diferenciación de los linajes. El cambio en el sistema de activación tuvo como objetivo pasar del uso de CRISPR/dCas9VP160, cuya función principal es reclutar factores de transcripción, al sistema CRISPR/dCas9p300 que\nacetila regiones promotoras para activar genes, que resulta más potente por su acción directa. Además, como los genes blanco se expresan en etapas más avanzadas del\ndesarrollo preimplantatorio bovino, la microinyección se realizó con ADN circular del\nsistema CRISPR/dCas9p300, debido a su mayor estabilidad. Según nuestros\nresultados, a priori, el sistema CRISPR/dCas9p300 no resultó efectivo para modular la expresión endógena de los genes CDX2 y GATA3, por el secuestro de la proteína en el citoplasma de las blastómeras del embrión.\nFinalmente, buscamos evaluar el efecto de la activación endógena, mediante el sistema CRISPR/dCas9VP160, de los genes CDX2 y GATA3 en estadios avanzados\ndel desarrollo embrionario preimplantatorio bovino, utilizando ADN circular. Con esta nueva estrategia, los resultados demostraron que el uso de ADN del sistema\nCRISPR/dCas9VP160 resultó efectivo para modular la expresión de los genes CDX2 y GATA3, al menos hasta el día 4 del desarrollo embrionario. La activación de la expresión\ngénica de CDX2 indujo la expresión de genes río arriba de éste, relacionados al linaje trofoblástico, como TFAP2C y SMARCA4, indicando una posible regulación asociada al\nlinaje trofoblástico. Además, la activación de GATA3 indujo la expresión de un gen del linaje trofoectodérmico, como CDX2. La proteína dCas9VP160 se localizó en el núcleo del embrión, como es de esperar para su función, aunque no hubo efecto sobre el\nnúmero de células del trofectodermo.\nEn los tres capítulos de esta tesis los parámetros de calidad embrionaria no\nmostraron efectos deletéreos respecto del control FIV, debidos a la propia técnica de\nmicroinyección o por la introducción del sistema CRISPR/dCas9 en el cigoto.\nEstos resultados presentan al sistema CRISPR/dCas9 como una estrategia muy útil\npara corregir la expresión aberrante de genes en embriones producidos in vitro, o bien para aumentar el número de células del trofectodermo de embriones producidos in vitro,\ny tener así un impacto en las tasas de implantación y producción de crías saludables.\n
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias