Exploración de nuevas moléculas base como posibles inhibidores de metalo-?- lactamasas de importancia clínica

• Autores: Corinaldesi, Alfredo
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Power, Pablo; Costamagna, Sixto Raúl; Gómez, Sonia Alejandra; Catalano Macri, Mariana
• Materia: ?- lactamasas; Inhibidores; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Corinaldesi, Alfredo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
En la década de 1920, Alexander Fleming descubrió accidentalmente una sustancia que\ninhibía el crecimiento de bacterias, la cual llamó "Penicilina" debido al hongo que la\nproducía (Penicillum chrysogenum). Desde entonces, los antibióticos se han utilizado\nen la industria y la salud con numerosas aplicaciones beneficiosas. De hecho, se\nconsidera por muchos autores como el mayor descubrimiento médico del siglo XX, ya\nque ha salvado innumerables vidas desde su introducción en las prácticas médicas.\nEn la clínica, los antibióticos se utilizan para tratar y prevenir infecciones bacterianas,\nya sea de forma directa o preventiva en tratamientos médicos como la quimioterapia y\nlas cirugías [1,2]. Sin embargo, algunos años después del descubrimiento de Fleming, se\ninformaron cepas de bacterias productoras de enzimas que podían reducir o\nneutralizar la acción de los antibióticos. La frecuencia de aparición de estas cepas\nresistentes se incrementó tanto que el año 2000 se considera el "fin de la era de los\nantibióticos".\nEl descubrimiento de mecanismos de diseminación y la pérdida significativa de la\neficacia antibiótica han generado una alerta en el sistema sanitario. De hecho, en 2014,\nla Organización Mundial de la Salud (OMS) advirtió que la resistencia microbiana a los\nantibióticos (RAM) es una de las mayores amenazas para la salud mundial, la seguridad\nalimentaria y el desarrollo social. Este fenómeno puede afectar a cualquier persona, sin\nimportar su edad o lugar de residencia, y prolonga las estancias hospitalarias, aumenta\nlos costos médicos y la tasa de mortalidad.\nUn estudio exhaustivo a nivel mundial estimó un total de casi 5 millones de muertes\nasociadas a bacterias resistentes en 2019. Se prevé que para 2050, la cifra de\nfallecimientos aumente a 10 millones debido a esta causa [2].\nLa resistencia bacteriana es un fenómeno natural y espontáneo, pero se ha visto\nacelerado debido al aumento de la presión selectiva por el uso excesivo e indebido de\nlos antibióticos en la industria y en las terapias médicas [3].\nLas aplicaciones que han acelerado la RAM incluyen el uso indebido de los antibióticos\ntanto en la salud humana como en la veterinaria, la profilaxis en ganadería, el control\nde plagas en la agricultura y su uso como biocidas en artículos de tocador y limpieza.\nLos mecanismos desarrollados por las bacterias para generar resistencia incluyen la\nimpermeabilidad, los sistemas de eflujo, la alteración de blancos moleculares y la\nproducción de enzimas capaces de inactivar los antibióticos. Destacan las llamadas ?-\nlactamasas (BLA), que son enzimas capaces de alterar la estructura de los antibióticos\n?-lactámicos, lo que hace que pierdan su actividad. Las Metalo-?-Lactamasas (MBL) son\nun grupo de BLA que utilizan metales como cofactores y se han vuelto muy relevantes\ndebido a su capacidad para conferir resistencia a antibióticos de última generación y a\nsus mecanismos eficaces de diseminación.\nLa Organización Mundial de la Salud ha solicitado el desarrollo de compuestos con\ncapacidad para inhibir la actividad de BLAs (Inhibidores), y aunque el ácido clavulánico\nes uno de los inhibidores más conocidos y empleados actualmente, lamentablemente\nno existe ningún inhibidor clínicamente útil para MBLs. El objetivo de este trabajo fue\nprobar la capacidad inhibitoria de compuestos seleccionados bajo diversos criterios,\ncomo su permeabilidad selectiva a membranas procariotas, su baja toxicidad en células\nhumanas y su actividad quelante, lo que les otorga potencial como inhibidores al\nsecuestrar cationes metálicos del medio, afectando tanto la actividad como la\nestructura de las MBLs [5]. Para probar su potencial, se llevaron a cabo ensayos IN VIVO,\nque incluyeron ensayos de susceptibilidad antibiótica con cepas portadoras de distintas\nMBL, resistentes a antibióticos de última generación, ensayos IN VITRO que culminaron\ncon la producción de una proteína recombinante (MBL) con la que se realizaron\nestudios cinéticos para evaluar las modificaciones en su actividad después de la\nincubación con los diversos compuestos seleccionados y ensayos IN SILICO, que\nconsistieron en la búsqueda de las secuencias aminoacídicas de MBLs en bases de datos,\nla generación de modelos moleculares, y modelos de Docking para predecir\ninteracciones entre las enzimas y los compuestos cuyo potencial inhibitorio se intenta\ndemostrar.\nPara producir las proteínas, se utilizó un protocolo de clonado que implicó un diseño\nde primers o cebadores, la construcción direccionada de un plásmido recombinante con\nun vector de clonado, la construcción direccionada de un plásmido recombinante con\nun vector de expresión (sub-clonado), la transformación celular, la inducción y, por\núltimo, la purificación de las proteínas expresadas. Después de purificar las proteínas\nrecombinantes, se realizaron ensayos cinéticos para obtener valores de constantes\ncomo la Actividad Remanente, la Constante de Inhibición (CI) y la Constante de\nInhibición 50% (IC50). Estos ensayos implicaron medir la variación en la capacidad de\nhidrólisis de las MBL debido a la presencia de los posibles inhibidores, a través de preincubaciones\ny midiendo el consumo del sustrato en función del tiempo.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica