Estudio de acuaporinas vegetales pertenecientes a la familia PIP : análisis de las relaciones estructura-función de homo-tetrámeros y tetrámeros mixtos PIP1-PIP2

• Autores: Jozefkowicz, Cintia
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Alleva, Karina; Rossi, Rolando; Parisi, Mario; Marinelli, Raúl
• Materia: PIP; PIP1; PIP2; Acuaporina; Membrana plasmáticas; Homotetrámeros; Tetrámeros; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

In the present Thesis we evaluated the capacity of plant aquaporins belonging to the PIP subfamily to assembly as hetero-tetramers. With this aim, we investigated the functional properties of two aquaporins belonging to the PIP2 group regarding their interaction with PIP1. Our results show that it is not correct to generalize that all PIP2 are able to interact with all PIP1, as we proved that the interaction between PIP1 and PIP2 is dependent on specific pairs of PIP1 and PIP2 proteins. We identify the first extracellular loop of PIP2 as a key structural element in the interaction between monomers in the tetramer and also as a possible controller of the hetero-tetramerization phenomenon. We also probed that the hetero-tetramerization between PIP1-PIP2 do not have a stoichiometric constrain and depends on the relative quantities of PIP1 and PIP2 monomers which are co-expressed in the cell. Moreover, hetero-tetramers with all the possible stiochiometries present equal biological activity in terms of water transport and pH intracellular regulation, being these functional properties different from the ones observed for homo-tetramers. In summary, this work shed light on the hetero-tetramerization of PIP channels as a new relevant mechanism to adjust plasma membrane water transport of plant cells.
Fil: Jozefkowicz, Cintia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina
La asociación específica de canales de membrana plasmática de las células vegetales para formar arreglos oligoméricos es un evento biológicamente relevante porque confiere ventajas funcionales a la fisiología celular vegetal. En el caso de las acuaporinas de plantas, se sabe que estas se encuentran como canales oligoméricos en distintas membranas de la célula vegetal y al momento de comenzar este trabajo doctoral se habían reportado evidencias que apoyaban que las acuaporinas vegetales de membrana plasmática (PIP) podrían interactuar para formar oligómeros mixtos mediante la combinación de monómeros del tipo PIP2 y PIP1. Sin embargo, restaba comprender el tipo de oligómero que forman los parálogos PIP1 y PIP2 y el tipo de estequiometría alcanzada al ensamblarse. Asimismo, si bien estaba ampliamente reportada la interacción funcional entre algunas PIP1 y algunas PIP2, no era claro si todas las PIP1 y todas las PIP2 son capaces de interaccionar, y se desconocían los determinantes estructurales que resultan claves para la interacción entre ambos subtipos de acuaporinas. Siendo este el estado de conocimiento sobre las relaciones estructura-función del grupo PIP de acuaporinas vegetales, el trabajo de tesis aquí presentado se centró en investigar la capacidad de las acuaporinas de este grupo para formar arreglos hetero-oligoméricos, determinando su actividad, regulación, localización, e indagando cuáles podrían ser los determinantes estructurales necesarios para que tenga lugar la interacción entre PIP1 y PIP2. Para lograr este objetivo, se examinaron las propiedades funcionales de 2 acuaporinas de Beta vulgaris tipo PIP2 en cuanto a su interacción con PIP1 y se evaluó la formación de distintas especies tetraméricas. Nuestros enfoques experimentales incluyen: i) la medición de la actividad biológica de los tetrámeros en cuanto a su capacidad de transportar agua; ii) el análisis de la localización de PIPs fusionadas a EYFP o ECFP por microscopía de fluorescencia confocal; iii) el diseño y la evaluación funcional de mutantes que permitan estudiar la interacción PIP1-PIP2; iv) la realización de construcciones homo y hetero-diméricas de PIP1 o PIP2; v) el estudio de la regulación de la actividad biológica de los diferentes arreglos tetraméricos por cambios en el pH citosólico; y vi) la realización de estudios bioinformáticos y estructurales de PIPs in silico.\nLos resultados obtenidos durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral muestran que no es posible generalizar que cualquier miembro del grupo PIP2 es capaz de interactuar con cualquier miembro del grupo PIP1, siendo el primer loop extracelular de PIP2 un elemento estructural clave en la interacción entre monómeros en el tetrámero y un posible controlador del fenómeno de hetero-tetramerización. A su vez, hemos podido demostrar que distintos tipos de hetero-tetrámeros PIP1-PIP2 con estequiometrías 2:2, 1:3 y 3:1 son capaces de formarse y alcanzar la membrana plasmática en el sistema de expresión heterólogo de oocitos de Xenopus; lasevidencias experimentales halladas muestran que el ensamblado de PIP1-PIP2 en hetero-tetrámeros ocurre con estequiometría flexible y dependiente de la expresión relativa de cada uno de los parálogos. Interesantemente, todas las especies hetero-tetraméricas presentan igual actividad biológica en términos de transporte de agua y respuesta cooperativa a la regulación por pHint. Sin embargo, las propiedades de los hetero-tetrámeros PIP1-PIP2 difieren de las propiedades halladas para los homo-tetrámeros. Dado que la presencia en membrana plasmática de hetero-tetrámeros vs homo-tetrámeros depende de cantidad de proteínas PIP2 disponibles en relación a la cantidad de proteínas PIP1, y considerando que estos ensambles poseen importantes diferencias funcionales, el manejo de la expresión relativa PIP1/PIP2 se torna un mecanismo de regulación del transporte de agua en la célula vegetal. Así, nuestros hallazgos arrojan luz no sólo la estequiometría de los hetero-tetrámeros formados por PIP1-PIP2 y su funcionalidad biológica, cuestiones que estaban pendientes de ser elucidadas en el campo biofísico de las acuaporinas vegetales, sino también sobre la hetero-tetramerización de las PIPs como un nuevo mecanismo de regulación relevante para ajustar el transporte de agua a través de la membrana plasmática de las células vegetales.
Ciencias Bioquímicas
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica