Evaluación de diferentes métodos para la cuantificación de melatonina en sobrenadantes libres de células de aislamientos bacterianos ambientales - Danilovich, Mariana Elizabeth (2019)
La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) es una indolamina ubicua presente en plantas, microorganismos y humanos. En humanos, esta sustancia modula diversos procesos fisiológicos, incluidos el ciclo de sueño, metabolismo y sistema inmunitario. Adicionalmente, la melatonina (MEL) es un potente antioxidante empleado como ingrediente de complementos alimenticios. Actualmente, existen pocos métodos para la detección y cuantificación de esta sustancia, tales como HPLC con detector UV-visible con arreglo de diodos (HPLC-DAD) o de fluorescencia (HPLC-FLD), HPLC-MS-MS, GC-MS e inmunoensayos (ELISA). No obstante, la mayoría de las técnicas son costosas y requieren de grandes cantidades de solventes y equipamientos específicos, por lo cual no pueden ser utilizadas como técnicas de rutina. En estudios previos, se evaluó la producción de MEL por aislamientos bacterianos ambientales (Pseudomonas sp. P26, , Gordonia sp. H19 y Rhodococcus sp. F27, 016, 20 y P18) en medio Luria Bertani suplementado con 500 mg/L de triptófano como precursor. En sobrenadantes libres de células (SLC), se cuantificó la concentración de MEL por HPLC-DAD empleando una columna C18. Los objetivos de este trabajo fueron ensayar la rápida detección de MEL en SLC luego de 48 h de cultivo, empleando un método colorimétrico basado en el reactivo de Salkowski, y comparar los resultados obtenidos con los datos previamente determinados por HPLC-DAD. Para el desarrollo del método colorimétrico se construyó una curva de calibración con un estándar puro de MEL en el rango de concentraciones de 7,8 a 250 µg/mL, realizando por duplicado barridos espectrofotométricos para cada concentración de MEL. En las mezclas de reacción, se observó una coloración marrón característica con el incremento de la concentración de MEL. Mediante análisis estadísticos se determinó el rango óptimo de absorción de MEL (entre 450 y 481 nm). Debido a que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (prueba de Tukey) entre las absorbancias registradas en el rango mencionado, la curva de calibración del estándar se construyó a 450 nm. Por el método colorimétrico, se estimó una concentración de MEL de 43,64 µg/mL en cultivos de Gordonia sp. H19 y de 149,45 µg/mL en Rhodococcus sp. F27 en SLC sin concentrar, mientras que por HPLC-DAD se estimaron concentraciones de 60,07 µg/mL y 74,40 µg/mL, respectivamente, en SLC concentrados (4,005 µg/mL y 4,96 µg/mL en SLC sin concentrar). En los SLC del resto de los microorganismos se registraron valores de absorbancia a 450 nm empleando el método colorimétrico, mientras que por HPLC-DAD no se detectó la presencia de MEL. Probablemente, estos microrganismos producen otros compuestos indólicos que son detectados por el reactivo de Salkowski. En base a los resultados obtenidos, se concluye que el método colorimétrico ensayado no resultó adecuado ni específico para el estudio de la producción bacteriana de MEL, bajo las condiciones de cultivo evaluadas.