Desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas para el control de la Fiebre Hemorrágica Argentina - Nuñez, Denise Anabel (2019)
La Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA) es una grave zoonosis endemoepidémica de la región central de nuestro país, con una población en riesgo estimada en más de 5 millones de individuos, y una tasa de mortalidad en ausencia de tratamiento que puede llegar al 30%. El virus Junín (JUNV), agente causal de la FHA, se clasifica dentro del grupo de los mammarenavirus del Nuevo Mundo. La prevención de la FHA consiste en la aplicación de la vacuna a virus atenuado Candid #1, producida en nuestro país. Si bien la vacuna ha demostrado ser efectiva y segura para la prevención de la enfermedad en áreas endémicas, presenta ciertas desventajas al igual que otras vacunas a virus atenuados. En particular, individuos inmunocomprometidos, niños y jóvenes de hasta 15 años y mujeres gestantes no pueden recibir la vacuna. Por otro lado, el riesgo de reversión de la atenuación no puede descartarse. El objetivo del presente trabajo es generar una plataforma vacunal alternativa para la FHA, basada en adenovirus humano tipo 5 (Ad) que exprese simultáneamente las proteínas estructurales Z, NP y GPC de JUNV, que serían relevantes para la inducción de una respuesta inmune efectiva. Para la obtención del candidato vacunal se utilizó el kit comercial ViraPowerTMAdenoviral Expression System. Brevemente, se generó el cassette de expresión Z:NP:GPC, donde los genes de las tres proteínas virales se encuentran fusionadas en fase por medio del péptido autoclivable 2A. Luego, el cassette fue clonado en el vector de entrada pENTR4, generándose el plásmido pENTR4-Z:NP:GPC. Por medio de recombinación in vitro entre el vector de entrada y el vector pAd-CMV-DEST se obtuvo el plásmido pAd- Z:NP:GPC, que contiene las secuencias de JUNV bajo regulación del promotor de cytomegalovirus, en el contexto del genoma de un Ad que carece de los genes para las proteínas virales E1 y E3. Para la obtención del adenovirus recombinante Ad-Z:NP:GPC, el vector pAd- Z:NP:GPC fue transfectado en células HEK293A. Esta línea celular suplementa en trans la proteína E1 al vector defectivo, posibilitando la formación de las partículas de adenovirus recombinantes. El Ad- Z:NP:GPC generado fue caracterizado mediante técnicas moleculares. La inserción de las secuencias foráneas en el genoma recombinante fue confirmada mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos para los transgenes. Para analizar la expresión de las proteínas heterólogas, células HEK293A fueron infectadas con el Ad-Z:NP:GPC y a las 24 horas, la presencia de Z, NP, y GPC en extractos celulares totales fue evaluada mediante Western blot utilizando sueros específicos para las proteínas de JUNV. Estos experimentos revelaron que el polipéptido Z:NP:GPC se expresa y es procesado correctamente por la proteasa 2A. En conclusión, se logró desarrollar un candidato que dirije la expresión de las proteínas estructurales mayoritarias de JUNV.