Saccharomyces uvarum de ambientes naturales y bebidas fermentadas de la Norpatagonia: caracterización y potencial para elaborar sidras a bajas temperaturas - Gonzalez Flores, Melisa (2019)
Las levaduras responsables de la transformación del mosto de manzana en sidra pertenecen al género Saccharomyces, y en general a la especie Saccharomyces cerevisiae. No obstante, aun cuando ésta es la especie más abundante, otras levaduras de este género como Saccharomyces uvarum también han sido descriptas en este proceso. S. uvarum presenta características únicas que incluyen un sistema activo de transporte de fructosa (azúcar mayoritario en el mosto de manzana), buena capacidad fermentativa y criotolerancia. Produce además menor cantidad de etanol y mayor de glicerol que S. cerevisiae, y un perfil de compuestos volátiles que influyen directamente en el aroma del producto como el alcohol superior 2-feniletanol y su respectivo éster de acetato.La gran diversidad de cepas de S. uvarum que coexisten en la Patagonia, tanto en ambientes naturales como en bebidas tradicionales, ofrecen un escenario ideal para estudiar de manera comparada las características fisiológicas y genotípicas de las distintas cepas y su potencial como cultivos iniciadores para la elaboración de sidras con características particulares y con impronta 100% patagónica. El objetivo de esta Tesis fue evidenciar la presencia de S. uvarum en sidras fermentadas a baja temperatura en la Norpatagonia y comparar fisiológica y genéticamente las cepas disponibles de esta especie obtenidas de diferentes ambientes a fin de conocer sus principales diferencias asociadas a su origen y su potencialidad para ser usadas como cultivos iniciadores en la producción de sidras con características organolépticas diferenciales. En el primer capítulo de esta Tesis se evaluó el comportamiento fermentativo y otras propiedades tecnológicas y fisiológicas de interés para la elaboración de sidras, de 21 cepas de S. uvarum aisladas de chicha de manzana y sustratos naturales de la Norpatagonia y 13 cepas de su especie hermana S. eubayanus aisladas de los mismos ambientes naturales. Se observó un comportamiento similar entre cepas de igual origen, es decir las sidras fermentadas con cepas aisladas de ambientes naturales de ambas especies (S. uvarum y S. eubayanus) presentaron características fisicoquímicas y cinéticas similares, diferenciándose de las fermentadas con cepas de S. uvarum aisladas de chichas. Se analizó posteriormente la producción de metabolitos secundarios asociados con el aroma de las sidras utilizando una cepa seleccionada de cada especie y origen. Nuevamente, los perfiles obtenidos con las cepas aisladas de ambientes naturales (S. uvarum NPCC1290 y S. eubayanus NPCC1292) fueron similares, destacándose ambas por producir altas concentraciones de 2-feniletanol, mientras que la cepa aislada de chicha (S. uvarum NPCC1314) produjo concentraciones más elevadas de ésteres en general. Se seleccionó la cepa S. uvarum NPCC1314 para realizar fermentaciones con mosto de manzana no estéril a escala semi-piloto, utilizando como comparación la cepa comercial S. cerevisiae BO213, usada para elaborar sidras en la región. Las fermentaciones se realizaron a 20°C y a 13°C obteniendo mayor implantación de S. uvarum (66% vs 100%, respectivamente) a 13ºC. La levadura comercial evaluada no se implantó en ninguna condición. El análisis sensorial mostró preferencia por la sidra fermentada con S. uvarum NPCC1314 a 20ºC y por S. cerevisiae BO213 a 13ºC. En paralelo, se realizó la búsqueda de nuevas cepas de S. uvarum en sidras, utilizando baja temperatura (13ºC) como agente selectivo. Se detectaron varias cepas de S. uvarum, sólo a 13ºC y en mosto Red Delicious. Este hallazgo representa el primer reporte de aislamiento de cepas de esta especie en un proceso fermentativo industrial en Argentina. Con estas nuevas cepas se realizó la misma caracterización fisiológica realizada previamente y se seleccionó la cepa de S. uvarum NPCC1420 para realizar fermentaciones a 13ºC, a escala semipiloto utilizando mostos manzana (variedades Granny Smith y Pink Lady) y pera (Packams/D´Anjou). Se utilizó con fines comparativos en este caso, la cepa de chicha S. uvarum NPCC1314. Los mayores porcentajes de implantación en esta oportunidad se obtuvieron con la cepa de sidra S. uvarum NPCC1420; y el análisis sensorial mostró preferencia por las sidras fermentadas con esta levadura solo en mosto de manzana Pink Lady, mientras que en mosto Granny Smith las sidras preferidas fueron las fermentadas con la levadura aislada de chicha. En el segundo capítulo de la Tesis se realizaron ensayos comparativos a nivel genético y fisiológico utilizando todas las cepas de S. uvarum aisladas en este trabajo (33) y además 28 cepas de la misma especie aisladas de diferentes países de Europa y sustratos. Utilizando datos de secuencia de siete genes nucleares el análisis de estructura poblacional evidenció por primera vez tres subpoblaciones en la Patagonia, hasta ahora sólo sugeridas pero no respaldadas por análisis poblacionales quizás por el bajo número de cepas de ambientes fermentativos disponibles hasta ahora: Sudamérica-A, Sudamérica-B y Holártica. La subpoblación Sudamérica-B, altamente diferenciada del resto y representada únicamente por cepas aisladas de ambientes naturales, comparte nicho con la subpoblación Sudamérica-A sin evidenciar flujo génico. Las cepas aisladas de sidra pertenecieron principalmente a la subpoblación Holártica y las de chicha resultaron una mezcla de Holárticas y Sudamérica-A. El análisis del gen mitocondrial COX2 si evidenció cierto flujo génico entre las dos subpoblaciones de ambientes naturales.A nivel fisiológico se evaluó la respuesta de todas las cepas a diferentes condiciones de estrés típicas del proceso de elaboración de sidras: crecimiento en diferentes temperaturas y crecimiento en diferentes concentraciones de etanol, de SO2 y de nitrógeno fácilmente asimilable. Se observó que las cepas europeas presentaron una mejor adaptación a temperaturas bajas (a 13°C) en relación a las patagónicas (independientemente del origen). Las cepas aisladas de ambientes naturales (patagónicas y europeas) presentaron muy baja resistencia al etanol. Asimismo, las cepas aisladas de ambientes fermentativos europeas mostraron un mayor requerimiento de nitrógeno que las de ambientes naturales. Por último, las cepas fermentativas europeas y las cepas de sidra de la Patagonia mostraron la mayor resistencia al SO2, mientras que las de ambientes naturales y chicha una muy baja resistencia. Se evidenció en las cepas resistentes una traslocación entre los cromosomas XVI y el VII (7 cepas europeas y 3 patagónicas, todas fermentativas) que involucra al gen del trasportador de sulfito SSU1 y en ensayos de expresión diferencial del gen SSU1 en condiciones de fermentación se observó un incremento en su expresión mayor a 10 veces en las cepas europeas con la traslocación respecto de las patagónicas en fermentaciones con y sin sulfito, pudiendo concluir que esta traslocación provoca la expresión constitutiva del gen, lo que le otorga una alta resistencia a las cepas que contienen la traslocación. Estos datos pusieron en evidencia diferencias fisiológicas entre cepas de S. uvarum que podrían relacionarse al proceso de elaboración de bebidas fermentadas. Las principales diferencias fisiológicas observadas no se asocian directamente con las relaciones filogenéticas existentes entre las cepas sino que más bien responden al ambiente de origen de las cepas en particular.