Estudio de la interacción lípido-proteína sobre la función y la organización del receptor de acetilcolina nicotínico en membranas y en sistemas modelos simples - Perillo, Vanesa Liliana (2014)
En esta Tesis doctoral se profundizó en el estudio de la interacción lípido-receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) en dos aspectos: por un lado, el mecanismo de inhibición de ácidos grasos libres (AGLs), antagonistas no competitivos del AChR, y por el otro, la ubicación del AChR en dominios líquido-ordenados (Lo) condicionada por dos características particulares de la membrana. Con la finalidad de dilucidar el mecanismo de antagonismo de los AGLs sobre el AChR, se utilizaron AGLs con un doble enlace único en diferentes posiciones de una cadena acílica de 18 átomos de carbono. Estudios funcionales realizados con la técnica de patch-clamp han mostrado que solo el cis-6-18:1 y el cis-9-18:1 reducen la duración del estado de canal abierto del receptor, sugiriendo, por lo tanto, un mecanismo de bloqueo alostérico del canal. Mediante espectroscopía de fluorescencia se comprobó que todos los AGLs se ubican en la interfase lípido-AChR, quedando el cis-6-18:1 restringido a los sitios denominados sitios anulares, mientras que el resto de los AGLs ocupa también sitios no-anulares. Por otro lado, estudios de polarización de fluorescencia mostraron que el AGLs cis-9-18:1 es el que ocasiona el mayor desorden en la membrana. Se comprobó i) que todos los cis-AGLs generan cambios conformacionales del AChR a nivel transmembrana, ii) que los cis-9-18:1, cis-11-18:1 y cis-13-18:1 perturban al AChR en su estado de reposo e iii) que los cis-6-18:1 y cis-9-18:1 son los que causan una mayor perturbación del estado desensibilizado. De esta manera, la posición e isomería del ángulo de torsión de los AGLs insaturados serían un factor clave en el bloqueo del AChR, sugiriendo entonces que los AGLs con un único doble enlace y ubicados superficialmente en la membrana inhiben en forma directa la función del AChR, posiblemente al perturbar una secuencia aminoacídica transmembrana involucrada en los cambios alostéricos necesarios para la apertura del canal iónico. Se postula que en la membrana plasmática el AChR se encuentra en dominios lipídicos denominados ?balsas? (?rafts?). Sin embargo, el AChR no muestra preferencia por dominios Lo en sistemas modelo compuestos por esfingomielina (SM), colesterol (Col) y POPC (1:1:1), pero sí lo hace un segmento transmembrana (γM4) que exhibe mayor contacto con los lípidos. Es decir, su distribución no dependería exclusivamente de sus propiedades intrínsecas sino también de señales extrínsecas a la proteína. En este trabajo de Tesis se estudió la posible partición diferencial del AChR en los dominios Lo en dos sistemas modelo diferentes en función de: a) la presencia de diferentes especies puras de SM en la membrana, y b) la existencia de asimetría transbicapa en el sistema modelo, mediante el agregado de SM de cerebro (bSM) en la hemicapa externa. Tanto la existencia de asimetría como la presencia de 16:0-SM o 18:0-SM, en comparación con las bSM y 24:1-SM, producen una partición preferencial del AChR en los dominios Lo. De este modo, la localización del AChR en estos dominios depende no solo de sus propiedades sino también de las características propias de la membrana en la que se encuentra. Entender la interacción lípido-AChR es de gran importancia para determinar tratamientos que puedan mejorar o inhibir la función del AChR y tratar enfermedades que lo involucren.