Purificación y evaluación funcional de un factor de crecimiento fibroblástico básico humano expresado en plantas transplastómicas - Müller, Carolina (2023)
El factor de crecimiento fibroblástico básico (FGFb) es una proteína con funciones claves en el desarrollo de mamíferos. A través de la regulación de distintas cascadas de señalización, esta proteína está involucrada en el mantenimiento del estado pluripotente de células madre in vitro y la regulación de su diferenciación. Las líneas celulares con propiedades de células madre constituyen un modelo de estudio central en ciencias biomédicas, con un importante potencial para el desarrollo de terapias regenerativas. El objetivo de este trabajo es estudiar un sistema de expresión alternativo basado en el uso de plantas como biorreactores para producir y purificar el factor de crecimiento recombinante básico humano (hrFGFb). Elegimos como sistema de expresión la transformación estable del genoma plastídico, debido a su potencial para expresar y acumular altos niveles de proteínas heterólogas. Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum por biobalística y se obtuvieron dos líneas de plantas transplastómicas que expresan la proteína hrFGFb fusionada a una etiqueta de histidinas amino-terminal. Se realizó la caracterización molecular por Southern blot, pudiendo corroborar la integración del transgén y la naturaleza homoplástica de las líneas obtenidas. Mediante la técnica de western blot, se analizó la expresión de la proteína recombinante hrFGFb en hojas de distintos estadíos de desarrollo, observando valores similares de acumulación de la proteína recombinante en las distintas hojas. Para la purificación de la proteína hrFGFb a partir de hojas de plantas transplastómicas, se desarrolló un protocolo basado en cromatografía de afinidad por columnas de níquel (Ni-NTA). Se evaluaron las distintas fracciones de la purificación mediante SDS-PAGE y se analizó el perfil de purificación mediante una tinción de proteínas totales (coomasie brilliant blue). A su vez, se verificó la identidad de la proteína recombinante purificada a partir de un ensayo de western blot con anticuerpos específicos. Se determinó la actividad biológica del hrFGFb purificado mediante un ensayo de proliferación en células HEK293T, en el cual se midió la proliferación celular mediante el método de Alarm Blue luego de 24 horas de estímulo con hrFGFb. Como control negativo se utilizó un extracto purificado de plantas de Nicotiana tabacum sin transformar y como control positivo, el tratamiento con hrFGFb comercial (Gibco, PHG0026). Se registró un aumento significativo en la proliferación en células estimuladas con ambos tipos de hrFGFb. En conjunto, estos resultados demuestran que es posible producir y purificar un hrFGFb biológicamente activo utilizando plantas transplastómicas.