Activación de genes endógenos humanos de precursores óticos y de células ciliadas del oído interno mediante CRISPR-VP160

Autores
Perez Raffo, Gabriela; Vigezzi, Lucía; Giménez, Carla Alejandra; Boccio, Carlos Mario; Pereyra Bonnet, Federico Alberto
Año de publicación
2018
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
artículo
Estado
versión publicada
Descripción
ntroducción: Últimas investigaciones en la biología celular y molecular del oído interno han aportado evidencias que apoyan nuevas modalidades terapéuticas en medicina regenerativa para restablecer la audición. Recientemente se ha utilizado elsistemaCRISPR-VP160paramejorarlosensayos de reprogramación celular de manera in vitro e in vivo. CRISPR-VP160 se compone de una endonucleasadesactivada(dCas9)fusionadacondominios de activacióndela transcripción (VP160),queutilizan un ARN guía para localizar un gen target y activarlo. El objetivo de este trabajo fue evaluar si el sistemaCRISPR-VP160puede activarlaexpresión de genes del oído interno (SOX2, ATOH1, POU4F3 Y GFI1)enlalíneacelularHEK293T. Material y método: Se diseñaron cuatro ARN guías que reconocieran al promotor de cada gen target, usando la herramienta de diseño CRISPR (Feng ZhangLab,MIT).LosARNguíasseclonaronenel plásmidoAddgene#47108yselipofectaronjuntoal plásmido dCas9-VP160 (Addgene#48226), en una relación de 1:1 en las células HEK293T. Las células del grupo control fueron cotransfectadas con el plásmidodCas9-VP160 yunplásmido guía vacío. Los resultados fueron analizados por RT-qPCR al día 4 post-lipofección. Resultados:ElsistemaCRISPR-VP160activósignificativamente a SOX2, ATOH1 y POU4F3(p<0.05), mientras que no se observó una activación significativa de GFI1, fenómeno que podría explicarse por la expresión preexistente de este gen en la línea celular. Conclusiones: En un futuro, el sistema CRISPRVP160 podría emplearse para mejorar las estrategias de reprogramación de células, para desarrollar nuevas terapias celulares en pacientes hipoacúsicos.
Introduction: Recent researches in cell and molecular biology of the inner ear bring evidence that helps the development of new therapeutic practice in regenerative medicine to restore hearing. The CRISPR system has been used to improve cell reprogramming assays both in vitro and in vivo. This consists of the inactive DNA-nuclease Cas9 (dCas9)fusedtoactivationdomainsandco-expressedsingleguideRNAs(sgRNAs)thataredesigned to hybridize a target sequence. Combined, these elements recognize a target locus and activate a specific gene. The objective of this work was to evaluate whether CRISPR-on system fused with transcriptional activators (dCas9-VP160) could activate geneexpressionofinnereargenes(SOX2,ATOH1, POU4F3andGFI1)inHEK293Tcellline. Material and method: Four guides were designed to recognize the proximal promoter of each target gene, using the CRISPR design tool (Feng Zhang Lab,MIT).ThesgRNAswereclonedintoplasmid Addgene#47108andlipofectedtogetherwithplasmiddCas9-VP160(Addgen#48226),atamassratio of 1:1in HEK293T cells. Control group was co-lipofectedwithplasmiddCas9-VP160andanempty guide plasmid. The results were analyzed by RTqPCR at day 4 post-lipofection. Results: The CRISPR-VP160 system significantly activated SOX2, ATOH1 and POU4F3 (p<0.05), whereas it did not detect a significant activation of GFI1. This phenomenon could be explained by the preexisting expression of this gene in HEK293T cells. Conclusions:Inthefuture,theCRISPR-VP160system could be used to improve reprogramming strategies of cells, to develop new cellular therapies in hearing-impaired patients.
Fil: Perez Raffo, Gabriela. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Vigezzi, Lucía. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Giménez, Carla Alejandra. Hospital Italiano. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Boccio, Carlos Mario. Hospital Italiano; Argentina
Fil: Pereyra Bonnet, Federico Alberto. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Materia
CRISPR
GENE EDITING
EPIGENETICS
REGENERATIVE MEDICINE
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/
Repositorio
CONICET Digital (CONICET)
Institución
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
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Conclusiones: En un futuro, el sistema CRISPRVP160 podría emplearse para mejorar las estrategias de reprogramación de células, para desarrollar nuevas terapias celulares en pacientes hipoacúsicos.Introduction: Recent researches in cell and molecular biology of the inner ear bring evidence that helps the development of new therapeutic practice in regenerative medicine to restore hearing. The CRISPR system has been used to improve cell reprogramming assays both in vitro and in vivo. This consists of the inactive DNA-nuclease Cas9 (dCas9)fusedtoactivationdomainsandco-expressedsingleguideRNAs(sgRNAs)thataredesigned to hybridize a target sequence. Combined, these elements recognize a target locus and activate a specific gene. The objective of this work was to evaluate whether CRISPR-on system fused with transcriptional activators (dCas9-VP160) could activate geneexpressionofinnereargenes(SOX2,ATOH1, POU4F3andGFI1)inHEK293Tcellline. Material and method: Four guides were designed to recognize the proximal promoter of each target gene, using the CRISPR design tool (Feng Zhang Lab,MIT).ThesgRNAswereclonedintoplasmid Addgene#47108andlipofectedtogetherwithplasmiddCas9-VP160(Addgen#48226),atamassratio of 1:1in HEK293T cells. Control group was co-lipofectedwithplasmiddCas9-VP160andanempty guide plasmid. The results were analyzed by RTqPCR at day 4 post-lipofection. Results: The CRISPR-VP160 system significantly activated SOX2, ATOH1 and POU4F3 (p<0.05), whereas it did not detect a significant activation of GFI1. This phenomenon could be explained by the preexisting expression of this gene in HEK293T cells. Conclusions:Inthefuture,theCRISPR-VP160system could be used to improve reprogramming strategies of cells, to develop new cellular therapies in hearing-impaired patients.Fil: Perez Raffo, Gabriela. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. 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Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; ArgentinaFederación Argentina de Sociedades de Otorrinolaringología2018-09info:eu-repo/semantics/articleinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_6501info:ar-repo/semantics/articuloapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/11336/103599Perez Raffo, Gabriela; Vigezzi, Lucía; Giménez, Carla Alejandra; Boccio, Carlos Mario; Pereyra Bonnet, Federico Alberto; Activación de genes endógenos humanos de precursores óticos y de células ciliadas del oído interno mediante CRISPR-VP160; Federación Argentina de Sociedades de Otorrinolaringología; Revista de la Federación Argentina de Sociedades de Otorrinolaringología; 25; 3; 9-2018; 36-391666-9398CONICET DigitalCONICETspainfo:eu-repo/semantics/altIdentifier/url/http://faso.org.ar/revista/2018_25_3.htminfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/reponame:CONICET Digital (CONICET)instname:Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas2025-09-10T12:59:49Zoai:ri.conicet.gov.ar:11336/103599instacron:CONICETInstitucionalhttp://ri.conicet.gov.ar/Organismo científico-tecnológicoNo correspondehttp://ri.conicet.gov.ar/oai/requestdasensio@conicet.gov.ar; lcarlino@conicet.gov.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:34982025-09-10 12:59:49.217CONICET Digital (CONICET) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicasfalse
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Introduction: Recent researches in cell and molecular biology of the inner ear bring evidence that helps the development of new therapeutic practice in regenerative medicine to restore hearing. The CRISPR system has been used to improve cell reprogramming assays both in vitro and in vivo. This consists of the inactive DNA-nuclease Cas9 (dCas9)fusedtoactivationdomainsandco-expressedsingleguideRNAs(sgRNAs)thataredesigned to hybridize a target sequence. Combined, these elements recognize a target locus and activate a specific gene. The objective of this work was to evaluate whether CRISPR-on system fused with transcriptional activators (dCas9-VP160) could activate geneexpressionofinnereargenes(SOX2,ATOH1, POU4F3andGFI1)inHEK293Tcellline. Material and method: Four guides were designed to recognize the proximal promoter of each target gene, using the CRISPR design tool (Feng Zhang Lab,MIT).ThesgRNAswereclonedintoplasmid Addgene#47108andlipofectedtogetherwithplasmiddCas9-VP160(Addgen#48226),atamassratio of 1:1in HEK293T cells. Control group was co-lipofectedwithplasmiddCas9-VP160andanempty guide plasmid. The results were analyzed by RTqPCR at day 4 post-lipofection. Results: The CRISPR-VP160 system significantly activated SOX2, ATOH1 and POU4F3 (p<0.05), whereas it did not detect a significant activation of GFI1. This phenomenon could be explained by the preexisting expression of this gene in HEK293T cells. Conclusions:Inthefuture,theCRISPR-VP160system could be used to improve reprogramming strategies of cells, to develop new cellular therapies in hearing-impaired patients.
Fil: Perez Raffo, Gabriela. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Vigezzi, Lucía. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Giménez, Carla Alejandra. Hospital Italiano. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
Fil: Boccio, Carlos Mario. Hospital Italiano; Argentina
Fil: Pereyra Bonnet, Federico Alberto. Hospital Italiano; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; Argentina
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