Nanovesículas arqueolipídicas ultradeformables como adyuvantes tópicos listos para usar - Caimi, Ayelen Tatiana (2019)
El objetivo general de esta tesis doctoral fue evaluar la capacidad de nanovesículas ultradeformables conteniendo arqueolípidos (AUD) de funcionar como adyuvantes tópicos. Es decir, por un lado, que puedan desencadenar una respuesta inmune antígeno especifica humoral, celular y de memoria tras su aplicación tópica al combinarlos con diferentes antígenos. Por otro lado, que cumplan con ser seguros, eficaces, estables, que no requieran cadena de frio para su almacenamiento, que se puedan producir por procesos simples y que se puedan mezclar con el antígeno antes de su administración. Previamente mostramos que AUD preparados a partir de arqueolípidos polares totales (APT) extraídos del arquebacteria hiperhalófila Halorubrum tebenquichense, fosfatidilcolina de soja (SPC) y colato de sodio (ColNa) (3:3:1 p/p) aplicados tópicamente pueden penetrar el estrato corneo (SC) e inducir títulos de IgG séricos antígeno-específicos. En el Capítulo 2, en primer lugar, estudiamos la estabilidad coloidal y perdida del contenido interno de AUD sometidos al estrés producido por cambios de temperatura, y la comparamos con la estabilidad de liposomas ultradeformables convencionales carentes de APT (LUD, SPC:ColNa 6:1 p/p). Luego se evaluó la estabilidad de AUD y LUD sometidos a esterilización por autoclave y se puso a punto un proceso de liofilización con el objeto de obtener un producto estéril y seco. La hipótesis fue que los APT les brindarían mayor estabilidad estructural a las bicapas frente a diferentes procesos por sobre vesículas carentes de APT. Los liposomas sufren cambios estructurales significativos cuando son calentados, por ejemplo, liposomas de SPC y colesterol o liposomas peguilados incrementan sustancialmente su tamaño y pierden su contenido interno cuando son autoclavados. Aquí hallamos que AUD, a diferencia de LUD pueden ser calentados sin perder su estabilidad coloidal: autoclavados o incubados por 6 h a 80 °C, mantienen su tamaño, aunque pierden su contenido acuoso. La liofilización es el método estándar para remover el agua y así prolongar la vida media de las formulaciones liposomales al almacenamiento. Previamente habíamos reportado que debido al contenido de colato de sodio, los LUD no pueden ser liofilizados, aún en presencia de altas concentraciones de sacarosa (10 y 20 % p/v). Especulamos que el contenido del disacárido manosaglucosa (0,072 % p/v provisto por el 8,2 % p/p del SDGD-5 en la mezcla de APT) sumado a la alta carga negativa (provista por el 55 % p/p de PGP-Me en la mezcla de APT) podrían proteger a los AUD frente a la liofilización. Esta asunción resultó parcialmente correcta: los AUD fueron más estables que los LUD al congelamiento, pero no a la deshidratación durante la liofilización. Los resultados sugieren que los APT son en parte crioprotectores, pero no lioprotectores. La crioprotección total se alcanzó agregando bajas cantidades de glucosa (0,07 % p/v) y glicerol (2,5 % v/v). Finalmente, la estabilidad coloidal tanto de las suspensiones como de los liofilizados tras 5 meses de almacenamiento a 4 y 40 °C mostró que AUD permanecieron sin cambios, en contraste LUD se agregaron. En suma, demostramos que los APT le confieren a los AUD estabilidad frente a esterilización por autoclave y almacenamiento en ausencia de cadena de frio. Los APT, sin embargo, fueron insuficientes para proteger a los AUD de la liofilización, lo que requirió la adición de glicerol y glucosa. A continuación, evaluamos las estrategias de administración de antígeno y adyuvante (encapsulación en el interior acuoso, adsorción superficial o administración separada) sobre la respuesta inmune generada tras la administración tópica en modelos animales y finalmente evaluamos la conservación de las propiedades adyuvantes de AUD luego de ser esterilizados y liofilizados. Sorprendentemente, no hallamos diferencias en la magnitud ni duración de la respuesta medida como títulos de IgG séricos totales tras la administración de ovoalbúmina (OVA) incluida en el espacio acuoso interno de los AUD o adicionada externamente. La administración separada en el tiempo de AUD y OVA, en contraste, generó menor respuesta. Estos resultados sugieren que no es necesaria la incorporación del antígeno en los AUD para desencadenar la respuesta inmune sistémica, pero sí es necesaria la mezcla de ambos para su aplicación. El proceso de liofilización no modificó la respuesta inmune generada tras la aplicación tópica de AUD. Por último, el screening de la activación de esplenocitos mostró que no se consiguió una activación celular antígeno específica, sin embargo, AUD produjo mayor número de esplenocitos y liberación de IFN-, tanto estimulados con concanavalina A como con OVA, que LUD. Esto significaría que los AUD, aunque no son inmunogénicos per se, causarían un tipo de estímulo general inespecífico de la inmunidad celular una vez asociados a un antígeno. En definitiva, se logró obtener una formulación estéril, seca y estable, que no requiere del uso de cadena de frío, lista para usar tópicamente que puede ser mezclada con el antígeno de interés en el momento de su administración, para la generación de reacción antígeno específica. La respuesta inmune producida por AUD, sin embargo, es menor a la alcanzada mediante la administración parenteral de vesículas hechas completamente de APT y los títulos del isotipo IgG2a son menores que los del isotipo IgG1, lo que sugiere una respuesta más del tipo humoral (Th2) que celular (Th1). La mayoría de las enfermedades generadas por virus o bacterias requieren de una inmunidad celular además de humoral y de memoria. Por lo tanto, en el Capítulo 3 se incorporó el inmunomodulador imiquimod (IMQ) a la estructura de los AUD para incrementar la respuesta de tipo celular. Nuestra hipótesis fue que la combinación de la penetración en la piel y el direccionamiento específico a células presentadoras de antígenos (CPA) de AUD con la actividad inmunomoduladora de IMQ mejoraría la respuesta inmunogénica tras su aplicación tópica, comparada con la generada por AUD sin IMQ e IMQ libre. En el Capítulo 3 preparamos y caracterizamos AUD incorporando y asociando IMQ a su estructura y evaluamos su captura, citotoxicidad y capacidad de inducir la liberación de citoquinas proinflamatorias en macrófagos y queratinocitos, su penetración en piel humana y sus propiedades adyuvantes in vivo utilizando OVA como antígeno modelo. El IMQ, es un ligando sintético del receptor intralisosomal TLR7 aprobado por la agencia regulatoria estadounidense (FDA) para el tratamiento tópico de la queratosis actínica, el carcinoma de células basales superficial y neoplasmas de piel inducidos por virus. IMQ induce la producción de ciertas citoquinas como IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 y IL-12 en células inmunes como monocitos/macrófagos, células dendríticas, células B, queratinocitos y granulocitos. IMQ produce la movilización rápida de las células dendríticas plasmacitoides y la activación de sus funciones citotóxicas. Aplicado tópicamente, IMQ induce la maduración de células de Langerhans y estimula la migración de CPA hacia los nódulos linfáticos donde promueven una respuesta celular específica. El IMQ, sin embargo, es prácticamente insoluble en solventes tanto hidrofóbicos como hidrofílicos. Sólo es soluble en soluciones acuosas ácidas (pH 2), en ácido láctico y ácidos grasos como ácido oleico, esteárico y linoleico. Por este motivo, no es posible la incorporación de IMQ en grandes cantidades en las nanovesículas ultradeformables. Considerando ese aspecto, sumado a que las drogas no necesariamente deben estar encapsuladas en el interior de las nanovesículas ultradeformables para penetrar el estrato corneo, preparamos AUD y LUD con IMQ en dos pasos: 1) IMQ disuelto en ácido linoleico se incorporó en la matriz/espacio interno de las vesículas (AUD1 y LUD1); 2) inmediatamente antes de su uso AUD1 y LUD1 se suplementaron con IMQ disuelto en ácido láctico (AUD2 y LUD2). AUD2 y LUD2 tuvieron un pH de 5,5 compatible con una formulación de uso tópico y no presentaron precipitado de IMQ. AUD2 presentó un tamaño de 250 ± 94 nm y potencial Z de -26 ± 4 mV, mientras que LUD2 presentó un tamaño de 280 ± 160 nm y potencial Z de -14,4 ± 4 mV. Estudios de deformabilidad y análisis del orden y fluidez de las bicapas realizado con la sonda Laurdan mostraron que parte del IMQ se incorporó en el espacio acuoso interno de las vesículas y parte se asoció electrostáticamente con la superficie de carga negativa de los AUD1 y en menor medida con los LUD1. A continuación, estudiamos la captura de AUD2 y LUD2 en macrófagos murinos (células J774A.1 como modelo de CPA) y queratinocitos (células HaCaT, principal tipo celular de la epidermis) utilizando vesículas con una doble marca fluorescente (rodamina-PE como marca de la bicapa lipídica y HPTS/DPX como marca del espacio acuoso interno) por citometría de flujo. Encontramos que AUD2 fueron más internalizados que LUD2 por los macrófagos, debido que APT son ligandos específicos de receptores scavenger de tipo A, expresados en células fagocíticas y CPA. Adicionalmente, hallamos que AUD2, una vez internalizadas, liberan su contenido acuoso de modo tal de incrementar la disponibilidad de IMQ intracelularmente. El IMQ es entonces reconocido por el receptor de TLR7 intraendosomal y es capaz de iniciar la secreción de citoquinas proinflamatorias. En queratinocitos, ambas formulaciones fueron internalizadas en menor magnitud que en los macrófagos, merced su interacción con el receptor de adenosina A2A superficial, encontrándose mayor captura tras la incubación con AUD2. A continuación, evaluamos la citotoxicidad e inducción de liberación de citoquinas proinflamatorias de IMQ libre, AUD2 y LUD2 en células J774 y HaCaT. La viabilidad de los macrófagos descendió en forma dosis- y tiempo-dependiente tras la incubación con IMQ libre, AUD2 y LUD2, resultando igualmente toxicas: a  8,5-13 µg/ml IMQ se redujo 85-90 % la viabilidad tras 48 h de incubación. Por otro lado, la viabilidad de los queratinocitos descendió solo tras la incubación con AUD2 y LUD2: 13,3 µg/ml y 4,7 µg/ml IMQ de AUD2 y LUD2, respectivamente redujeron 50% la viabilidad de células HaCaT tras 48 h de incubación. En macrófagos, el IMQ libre, así como AUD2 y LUD2 (a concentraciones no citotóxicas) indujeron la misma producción de IL-6 que fue menor a la inducida por lipopolisacárido (LPS); sin embargo, AUD2 indujo significativamente mayor cantidad de TNF- que el resto de las muestras incluyendo LPS. Por otro lado, en células HaCaT, AUD2 indujo mayor cantidad de IL-6 que el resto de las formulaciones, aunque ninguna indujo la producción de TNF-. Estos resultados sugieren que debido al mayor delivery del IMQ intraendosomal en los macrófagos y la mayor interacción con el receptor superficial de adenosina A2A en queratinocitos, AUD2 indujo mayor cantidad de citoquinas proinflamatorias que IMQ libre y LUD2. Tras realizar la caracterización fisicoquímica, y el estudio de citotoxicidad, captura y liberación de citoquinas proinflamatorias, evaluamos la penetración del IMQ en forma libre y como AUD2 y LUD2 en explantos de piel humana. La acumulación total del IMQ en la piel fue 3 veces mayor cuando se aplicó como AUD2 (30 ± 8 g/cm2 ) que como LUD2 (10 ± 3 g/cm2 ) y 1,5 veces mayor que como IMQ libre (20 ± 6 g/cm2 ). Finalmente evaluamos la respuesta inmune generada tras la aplicación tópica de IMQ, AUD2 y LUD2 utilizando OVA como antígeno modelo. AUD2 y LUD2 indujeron mayores títulos de IgG en comparación con IMQ libre. Además, mientras que IMQ libre no produjo isotipos IgG2a, la relación IgG2a/IgG1 (indicativa de la polarización Th1/Th2 en ratón) de LUD2 fue  0,5, similar a la obtenida previamente (Capitulo 2) para AUD (sin IMQ), lo que sugiere una respuesta de tipo humoral. AUD2, por otro lado, indujo una relación de isotipos 1, sugiriendo una respuesta mixta humoral/celular. Adicionalmente, evaluamos el efecto de la vacunación sobre la inmunidad celular, midiendo la liberación de IFN-γ y el índice de estimulación (IE) de los esplenocitos de los ratones vacunados re-estimulados con el antígeno (OVA). Los títulos de INF-γ normalizados por el IE de los esplenocitos de los ratones inmunizados con AUD2 fueron significativamente mayores que los correspondientes al resto de los grupos. En contraste los animales inmunizados con IMQ libre indujeron bajos títulos de INF-γ, mientras que los inducidos por LUD2 se hallaron debajo del límite de detección. En suma, los resultados sugieren que solo AUD2 indujo una respuesta de tipo celular. Por último, AUD1 permaneció estable coloidalmente por hasta 5 meses de almacenamiento a 4°C. La estabilidad de LUD1, en contraste, se perdió más rápidamente, luego de 1 mes de almacenamiento. A continuación, en el Capítulo 4 evaluamos la capacidad de AUD2 aplicado tópicamente de inducir inmunidad contra antígenos de influenza. Nuestra hipótesis fue que debido a las propiedades adyuvantes AUD2 podría mezclarse en el momento de su administración con una vacuna comercial y aplicado tópicamente inducir respuestas inmunes que podrían ser similares a la obtenida tras la administración parenteral, reduciendo así las desventajas del uso de aguas y jeringas (seguridad, disconformidad, necesidad de personal capacitado y rápida disponibilidad ante la necesidad de vacunaciones masivas en casos de pandemias). En este Capítulo, se evaluaron dos aspectos diferentes: i) la actividad del inmunomodulador IMQ como adyuvante, para lo que se observó si hay inducción de variaciones en el tipo y/o magnitud de la respuesta obtenida y ii) la performance de la administración tópica con respecto a la administración parenteral de la vacuna comercial. Para ello, se midió la respuesta inmune tras la aplicación tópica de IMQ, AUD vacíos, AUD + IMQ, AUD1 y AUD2 mezclados con una vacuna estacional comercial contra influenza sin adyuvante (Nilgrip, HA) y se comparó con la vacuna subcutánea. En primer lugar, hallamos que si bien la presencia de IMQ no indujo diferencias significativas en cuanto a los títulos de IgG séricos antígenoespecíficos respecto de vesículas sin IMQ, su presencia moduló el tipo de respuesta, lo que se puso de manifiesto tras la administración de AUD2, la formulación que más cantidad del inmunomodulador posee. Encontramos que su administración tópica indujo la generación de una relación de isotipos IgG2a/IgG1~1 y, además, la liberación de cantidades de INF-γ significativamente altas. Estos resultados, sugieren que AUD2 induce una respuesta de tipo celular que no se manifiesta con la aplicación tópica de AUD sin IMQ. Por otro lado, hallamos que la vacuna subcutánea comercial y la aplicación tópica de AUD2 mezclados con la vacuna, aunque no la vacuna tópica mezclada con IMQ, produjeron títulos de IgG séricos totales similares y relación de isotipos IgG2a/IgG11. Remarcablemente, los esplenocitos de los animales vacunados tópicamente mostraron mayor IE y liberación de mayor cantidad de INF- que los vacunados subcutáneamente. Adicionalmente, evaluamos si el sitio de administración podría modificar la respuesta tras la administración tópica. Hallamos que tanto la administración en las axilas, donde se encuentra una gran población de ganglios linfáticos, como en el lomo generó la misma magnitud y tipo de respuesta. Estos resultados sugieren que, al menos en términos de las medidas realizadas, la aplicación tópica de AUD con IMQ podría ser una opción a la vacunación subcutánea. Finalmente, en el Capítulo 5 estudiamos la actividad antitumoral de AUD2 contra melanoma. Nuestra hipótesis fue que la actividad pro-apoptótica TLR-7 independiente antitumoral del IMQ podría incrementarse o modificarse incorporado o asociado a AUD. En primer lugar, medimos la citotoxicidad utilizando el método de MTT y liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de IMQ libre, AUD2 y LUD2 como indicativos de la actividad metabólica y la integridad de la membrana citoplasmática de células de melanoma humano (Sk-Mel-28), respectivamente. A continuación, estudiamos la captura celular de AUD2 y LUD2 por células SkMel-28, y determinamos la existencia de muerte celular por necrosis o apoptosis mediante el estudio de la luz dispersada por citometría de flujo y microscopia de fluorescencia tras la tinción con YO-PRO/ioduro de propidio Hallamos que IMQ redujo 50 % la viabilidad medida por MTT, produjo un 100 % liberación LDH a 100 µg/ml tras 48 h de incubación y generó apoptosis sobre células Sk-Mel-28. La incorporación de IMQ en LUD y AUD modificó su farmacodinamia de dos modos diferentes. Por un lado, la incorporación de IMQ en LUD incrementó la toxicidad del IMQ (< 50 % de viabilidad y 80 % de liberación LDH tras 24 h a 13 µg/ml IMQ) conservando la capacidad de inducción de apoptosis del IMQ. Por otro lado, la incorporación de IMQ en AUD no incrementó la toxicidad del IMQ, aunque, produjo una toxicidad intrínseca de las matrices lipídicas (mayor a la generada por LUD2) con un incremento de la proporción de células necróticas. Encontramos que AUD2 fue significativamente más capturada que LUD2 por las células Sk-Mel-28. La mayor captura de AUD en comparación con LUD, sumado al contenido de ácido linoleico y arqueolípidos podrían relacionarse con la mayor toxicidad y disrupción de la integridad de la membrana plasmática. Estos resultados sugieren que AUD2 podrían tener un potencial en la terapia adyuvante de melanoma que sería necesario continuar investigando. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al desarrollo de adyuvantes tópicos estables y listos para usar.