Mecanismos de toxicidad de nanopartículas de plata en organismos acuáticos - Ale, Analía (2019)
La creciente producción y utilización de las nanopartículas de plata (AgNP) por sus eficientes propiedades biocidas llevan a su liberación en los ambientes en cantidades desconocidas, siendo los sistemas acuáticos los sumideros finales. El objetivo general de este estudio fue comprender los mecanismos de toxicidad de las AgNP en organismos acuáticos. Para ello, llevamos a cabo ensayos in vivo y ex vivo (branquias) con peces de agua dulce y moluscos marinos. Se seleccionaron concentraciones de AgNP bajas y ambientalmente relevantes a partir de un stock comercial de nanoplata coloidal (Nanotek S.A., nanArgen®).Un primer ensayo consistió en la exposición in vivo de juveniles de peces Porchilodus lineatus (sábalo) a: 0 (control); 2.5 y 25 µg AgNP L-1 (renovaciones cada 48 h) durante 5 y 15 días. La acumulación de Ag total en los tejidos aumentó ante ambas concentraciones y tiempos de exposición según la siguiente secuencia: hígado>branquias>intestino>cerebro. El índice hepatosomático de los peces aumentó luego de ambos tiempos de exposición en el caso de la concentración de 25 µg AgNP L-1. Respecto a las mediciones hematológicas, después de 5 días aumentó la cantidad de glóbulos rojos, los niveles de concentración media de hemoglobina corpuscular y la cantidad de monocitos; mientras que pasados los 15 días de exposición aumentó la cantidad de glóbulos blancos y monocitos, y disminuyeron la hemoglobina corpuscular media y la cantidad de linfocitos. En el mucus aislado de la superficie corporal de los peces expuestos por 15 días a ambas concentraciones de AgNP, se observó una disminución de la cantidad de unidades formadoras de colonias de bacterias. En cuanto a los marcadores de estrés oxidativo, en el hígado de los peces hubo un aumento de todas las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa -CAT-, glutatión S-transferasa -GST-, glutatión reductasa y glutatión peroxidasa) y disminución de la capacidad antioxidante luego de 15 días. Contrariamente, en las branquias se evidenció una inhibición de todas las enzimas luego de 5 días a 25 µg AgNP L-1, y peroxidación lipídica (LPO) a los 15 días de exposición. Además, luego de la exposición a la mayor concentración de AgNP se observaron alteraciones en los marcadores de costo energético: la glucosa y proteínas (Prot) plasmáticas aumentaron luego de 5 días, y el glucógeno hepático y muscular, y las Prot del músculo después de 15 días. Por otro lado, el análisis histológico de las branquias de los sábalos reveló una mayor cantidad de histopatologías y proliferación de células mucosas luego de 15 días a 25 µg AgNP L-1, lo cual sumado a la alteración de enzimas transaminasas deja en evidencia un severo daño de este órgano vital. Por último, se llevó a cabo un análisis multivariado que brindó una visión holística de los resultados, y claramente separó y demostró un perfil fisiológico diferente de los peces expuestos a 25 µg AgNP L-1 por 15 días. Además, ordenó los ejemplares según los diferentes tiempos de exposición.Por otra parte, se llevó a cabo un ensayo ex vivo con branquias de juveniles de peces Piaractus mesopotamicus (pacú) y adultos de Corydoras paleatus (quitasueños) para exponerlas (empleando una solución salina como medio) a AgNP y AgNO3. Se analizaron efectos tóxicos a través de biomarcadores de estrés oxidativo, y a la vez posibles mitigaciones de los mismos cuando estaban presentes ácidos húmicos (AH) en el medio. Los tratamientos fueron: solución salina (control); solución salina + 10 mg AH L-1 (control AH); 100 µg AgNP L-1; 100 µg AgNP L-1 + 10 mg AH L-1; 100 µg AgNO3 L-1; 100 µg AgNO3 L-1 + 10 mg AH L-1. Luego de 1 h de exposición, en las branquias de pacú hubo un aumento de la actividad de la enzima antioxidante CAT en los tratamientos con AgNP y la sal de plata. Por su parte, en las branquias del quitasueños se vieron disminuidos los niveles de glutatión y la actividad de la enzima GST en el caso de la exposición a AgNO3, y también aumentaron los niveles de LPO luego de la exposición a AgNP. Todos los efectos fueron atenuados cuando estaban presentes los AH en el medio. Por último, se desarrolló un ensayo in vivo con el molusco marino Mytilus galloprovincialis como organismo test, el cual fue expuesto a: 0 (control), 1 µg AgNP L-1 y 10 µg AgNP L-1 (renovaciones cada 24 h) durante 96 h. Los resultados demostraron un aumento en la acumulación Ag en el tejido blando del bivalvo. Los hemocitos revelaron una disminución de la estabilidad de las membranas lisosomales luego de ambas concentraciones de AgNP, y un aumento de la frecuencia de micronúcleos. En la glándula digestiva se evidenció un aumento de la actividad enzimática de GST y de los niveles de LPO. Los niveles de metalotioneínas aumentaron en caso de la exposición a 10 µg AgNPL-1. Por último, los transportadores en las membranas ABC de las células de las branquias se vieron inhibidos en el caso de la menor concentración de AgNP.Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis permitieron obtener una visión amplia e integradora de los efectos tóxicos que provocan concentraciones subletales y ambientalmente relevantes de AgNP. Las nanopartículas metálicas fueron capaces de ser capturadas por las células de los organismos y bioacumularse, independientemente del organismo test (peces o moluscos) y el medio de dispersión (agua dulce o agua de mar). También se comprobó, en el caso de los peces, que son capaces de afectar la composición del mucus, convirtiéndose en una amenaza para las comunidades de bacterias benéficas que viven sobre la superficie del organismo. Por otro lado, el mecanismo principal que explica los efectos tóxicos fue el estrés oxidativo, ya sea por la inducción o inhibición de las enzimas antioxidantes, agotamiento del glutatión, u ocurrencia de daño oxidativo en lípidos. El hígado de los peces, y la glándula digestiva en los moluscos fueron los órganos blanco de las AgNP. Por su parte, también las branquias de los peces resultaron un tejido clave para evaluar los efectos tóxicos en donde se evidenciaron tanto respuestas de defensa (proliferación de células de mucus) como daños a nivel estructural (histopatologías, transaminasas). Dado que la producción, uso y liberación creciente de AgNP son una amenaza real y emergente en los ecosistemas de agua dulce y marinos, la información generada en esta tesis representa un valioso aporte para propósitos de regulación y control ambiental.