Localización en dominios de membrana y biosíntesis de los esfingolípidos con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena de células espermatogénicas en diferenciación - Santiago Valtierra, Florencia Ximena (2019)
El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el avance de la maduración sexual y la diferenciación celular. El foco estuvo sobre las especies moleculares de esfingomielina (SM) y de ceramida (Cer) con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de muy larga cadena (VLCPUFA), que se presentan como VLCPUFA no hidroxilados (n-V) y 2-hidroxilados (h-V) de hasta 32 átomos de carbono en las CG de rata. Los objetivos específicos fueron i) investigar cómo se distribuyen estas especies moleculares entre las membranas de las CG, ii) determinar cómo cambia con el desarrollo testicular y la diferenciación celular la expresión de los genes que codifican a las enzimas responsables de la biosíntesis de los n-V y los h-V, iii) establecer si las CG aisladas son capaces de biosintetizar por sí mismas estas especies de Cer y de SM entre otras a través de la vía de novo y de expresar las correspondientes sintasas, y iv) inquirir sobre factores endocrinos y/o paracrinos capaces de modular dicha actividad y/o expresión. Los efectos del desarrollo se estudiaron en testículos de animales de distintas edades postnatales (P), y los de la diferenciación en poblaciones de CG en los estadios de espermatocitos en paquiteno (EP), espermátidas redondas (ER), y espermátidas elongadas o tardías (ET), aisladas a partir de las células totales (CT) del epitelio seminífero de ratas adultas. En algunas mediciones se incluyeron a los cuerpos residuales (CR) y a las células de Sertoli (SC). Las poblaciones de CG se aislaron utilizando gradientes continuos de albúmina. Los estudios que requirieron separación, aislamiento e identificación de clases de lípidos y especies moleculares se hicieron por técnicas cromatográficas de alta resolución y sensibilidad. Las investigaciones sobre biosíntesis de n-V o de esfingolípidos (SL) se hicieron en CG mantenidas en cultivo primario, siguiendo las transformaciones biológicas de sustratos radioactivos. La expresión de genes a nivel ARNm se comparó aplicando PCR cuantitativa, y a nivel proteína se evaluó utilizando técnicas de Western blot seguida de inmunomarcación con anticuerpos, y en cortes de tejido por microscopía de inmunofluorescencia. En la primera parte de la tesis se compararon la localización y la distribución de glicerofosfolípidos (GPL), colesterol y SM entre fracciones de membrana obtenidas de EP, ER y ET. El foco estuvo puesto en la distribución lateral de las especies moleculares de SM y Cer con VLCPUFA entre fracciones de membrana conteniendo dominios tipo raft y no-raft, partiendo de la hipótesis de que estas especies se verían excluidas de los primeros. Utilizando preparaciones de CT, inicialmente comparamos dos métodos, originalmente diseñados para estudiar la separación lateral de proteínas en membranas, para decidir cuál sería más apropiado para evaluar la distribución lateral de los lípidos. El método clásico, que utiliza detergente en frío para obtener fracciones de membrana ricas en dominios tipo raft, mostró bajas recuperaciones de lípido y proteína, separación incompleta de los lípidos entre dominios, interferencia del detergente en los análisis, e hidrólisis parcial de GPL y SM. Se encontró preferible un método que usa gradientes de sacarosa para separar fracciones de membrana sobre la base de su densidad a partir de homogenados totales (HT), pues permitió separar fracciones de membrana livianas, pesadas, y extra-pesadas (ML, MP y MEP, respectivamente) además de una fracción aún más pesada en el pellet o sedimento de la homogenización. La recuperación, tanto del fósforo lipídico como de la proteína, alcanzó, en promedio, un 85% del originalmente presente en los HT. Proteínas marcadoras mostraron que las pequeñas ML contenían dominios tipo-raft/caveolas, y las abundantes MP dominios no-raft, principalmente derivados de la membrana plasmática, mientras las MEP eran ricas en membranas intracelulares. Consistente con su rol como precursoras de esfingolípidos con VLCPUFA, especies de Cer con n-V y h-V se hallaron más concentradas en las MEP. Como se esperaba, las ML contenían GPL y SM con AG saturados, mientras las MP eran ricas en GPL con PUFA y SM con VLCPUFA. Llamativamente, tal vez debido a la alta insaturación de esos ácidos grasos, la relación colesterol/fosfolípidos fue más alta en las MP que en las ML. Con el avance de la diferenciación, el contenido de Cer con VLCPUFA, especialmente h-V Cer, tendió a aumentar en las MP de las CG en el sentido EP→ER→ET. En el mismo sentido, mientras los ácidos grasos de los lípidos de ML no variaron, en los de las MP las relaciones 22:5n-6/20:4n-6 en GPL y h-V/n-V en SM y en Cer aumentaron en forma altamente significativa. En la segunda parte, se determinó la expresión de enzimas que se espera jueguen un papel en la biosíntesis de los n-V y los h-V de SM y Cer. El foco estuvo puesto en la Elovl4 y la Fa2h, con la hipótesis, basada en lo que habían mostrado los lípidos, de que sus expresiones aumentarían con el desarrollo postnatal en el testículo y que, en las CG de animales adultos, variarían en sentidos opuestos, la primera disminuyendo y la segunda aumentando con la diferenciación. Seis de los 7 miembros de la familia de genes Elovl, se expresaron a nivel ARNm en CG. Los genes Elovl5 y Elovl2 se incluyeron en el estudio por codificar elongasas cuya actividad parcialmente se superpone, colaborando en la biosíntesis de PUFA, y porque Elovl2 es esencial en la formación de PUFA de 24 carbonos que sirven de sustrato a la Elovl4. Contrario a lo esperado, el nivel de ARNm de Elovl4 se halló elevado en testículos que virtualmente carecían de CG (y de SM o Cer con n-V), como lo fueron los de animales en edades infantiles (P14) y los de adultos (P90) que habían sido despojados de CG por exposiciones repetidas a episodios de hipertermia. Esta aparente inconsistencia se debió a que el nivel de ARNm de Elovl4 fue inesperadamente alto en las SC. Con la maduración sexual, los niveles de Elovl4-ARNm en el testículo decrecieron hasta la adultez, para permanecer luego relativamente constantes. Entre las células espermatogénicas del adulto, los contenidos más altos de este ARNm aparecieron en las ET y en los CR. En contraste con Elovl4, Fa2h no se expresó como ARNm en el testículo hasta la edad de aparición de las ER (P26), y sus niveles aumentaron con el crecimiento y la diferenciación celular. Como proteínas, ni Elovl4 ni Fa2h se expresaron en las SC. Elovl4 estuvo más concentrada en EP que en ER, en las que mostró una localización perinuclear. En el citoplasma de las ET apareció concentrada en pequeñas estructuras esféricas que podrían ser CR en formación. Como proteína, Fa2h se encontró especialmente concentrada en las ET, asociada a una estructura supranuclear que juega un rol importante en dar la forma definitiva a la cabeza de los futuros espermatozoides. Elovl4 y Fa2h no se detectaron en las gametas liberadas desde el epitelio seminífero. La actividad combinada de las elongasas en estudio (Elovl5, Elovl2 y Elovl4) se evaluó comparando las conversiones sufridas por el [3H]20:4n-6 en cultivos de EP, ER y ET, así como de SC. Este PUFA fue elongado en las cuatro poblaciones celulares a [3H]22:4 y [3H]24:4, y estos productos fueron activamente desaturados a [3H]22:5 y [3H]24:5. Como se esperaba, se encontraron n-V tetraenoicos y pentaenoicos marcados con [3H] de 26 y hasta 32 carbonos sólo en las CG. La actividad de elongación de PUFA decreció en el sentido EP→ER→ET. En la tercera parte, con la hipótesis de que las CG serían capaces de producir sus propios esfingolípidos, investigamos cómo espermatocitos y espermátidas biosintetizan Cer, SM y GlcCer, y cómo dicha actividad, así como la expresión de los genes de las correspondientes sintasas, cambian con la diferenciación. Paralelamente evaluamos la posibilidad de que la biosíntesis y/o la expresión génica estuvieran afectadas por la testosterona (Tes) y por factores solubles liberados desde las SC. Empleando como precursor al [3H]16:0 y dos inhibidores específicos de la ruta biosintética de novo (L-cicloserina y fumonisina B1) hallamos que las CG, aisladas y en cultivo, son capaces de biosintetizar sus propias Cer y SM, incluyendo sus especies moleculares con VLCPUFA, además de GlcCer. Estas actividades biosintéticas fueron máximas en los EP, disminuyendo con la diferenciación (EP>>ER). La Tes estimuló la biosíntesis de [3H]SM sólo en las ER. La suplementación con el medio condicionado obtenido de cultivos de SC (MCS) estimuló significativamente la formación de [3H]Cer tanto en EP como en ER, la de [3H]SM sólo en ER, y la de [3H]GlcCer sólo en EP. La Tes y el MCS incrementaron a todas las especies moleculares de Cer y de SM, incluyendo las n-V. En comparación con el MCS sólo, la combinación Tes+MCS promovió significativamente la biosíntesis de [3H]SM en los EP, mientras la redujo en las ER, en las cuales incrementó la marcación de [3H]Cer y de [3H]GlcCer. El estímulo sobre la marcación de Cer y SM fue específico para las [3H]n-V Cer y [3H]n-V SM. El significativo fomento que sobre la biosíntesis de novo ejerció el MCS indica que factores solubles (o transportados en microvesículas) provenientes de las SC (incluyendo tal vez distintas formas de ARN), juegan un rol en promover, en las CG, la biosíntesis de esfingolípidos destinados a sus membranas. En esta tercera parte de la tesis también se investigó la expresión a nivel ARNm de genes que codifican para cuatro sintasas (S) clave implicadas en la biosíntesis de SL (CerS3, SMS1, SMS2, y GlcCerS), de tres elongasas de ácidos grasos (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), y de Fa2h. Se encontró que los niveles de ARNm de CerS3 fueron máximos en EP y los de SMS2 máximos en ER, ambos disminuyendo en las ET. Los de GlcCerS disminuyeron menos que éstos con la diferenciación, y los de SMS1 no variaron. Los cuatro ARNm también aparecieron en los CR. Mientras CerS3 no se expresó en las SC, los ARNm de las demás sintasas se encontraron en ellas, aunque en cantidades menores que en las CG. En la última parte de esta sección se estudiaron, en las células espermatogénicas totales, los efectos de la Tes, del MCS, y de Tes+MCS sobre los niveles de ARNm de las enzimas mencionadas. Las expresiones como ARNm de Elovl2 y Elovl4 mostraron ser reguladas por el MCS, las de SMS2 y Elovl5 por MCS y Tes, y la de Fa2h sólo por Tes. La Tes y el MCS, tanto por separado como combinados, no afectaron los niveles de ARNm de CerS3, SMS1, o GlcCerS, mientras tendieron a reducir los de SMS2. La presencia de Tes no afectó el ARNm de Elovl2 ni el de Elovl4, mientras tendió a aumentar el de Elovl5. El MCS, por su parte, redujo significativamente los ARNm de las tres elongasas. Cuando Tes y MCS se combinaron, el ARNm de Elovl5 aumentó, y los de Elovl2 y Elovl4 continuaron bajos, recapitulando la influencia de Tes y del MCS, respectivamente. El efecto más significativo de la Tes, tanto sola como combinada con el MCS, fue el de estimular la expresión de Fa2h. Tomados en conjunto, estos resultados muestran por primera vez que factores que juegan roles fisiológicos en la espermatogénesis, como lo son la testosterona y moléculas liberadas desde las células de Sertoli, son capaces de estimular la biosíntesis de novo de esfingolípidos en las células espermatogénicas y de regular, en algunos casos a la alta y en otros a la baja, la expresión génica de algunas de las enzimas responsables de dicha biosíntesis.