Relevancia de la Acetiltransferasa de Histonas Myst4 sobre el mantenimiento de la pluripotencia y la diferenciación de Células Madre Embrionarias - Cosentino, María Soledad (2018)
La pluripotencia y autorrenovación, propiedades fundamentales de las células madre embrionarias (CME), son mantenidas por factores de transcripción (FT) específicos, siendo los más importantes Oct4, Sox2 y Nanog. Estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, actuando como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes de pluripotencia y de diferenciación celular. Esta regulación de la transcripción está relacionada con cambios en la estructura de la cromatina, generados por distintas proteínas remodeladoras que modifican las colas de las histonas o el DNA, mediante metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, etc. Estas enzimas mantienen la cromatina del estado pluripotente y realizan las modificaciones epigenéticas necesarias para comenzar la diferenciación de células madre pluripotentes (CMP). Se ha reportado que la acetiltransferasa de histonas Myst4 posee en su región promotora un elemento regulatorio altamente ocupado por estos FT en CME de ratón. Nuestra hipótesis postula que FT clave de células madre regulan la expresión de Myst4, y que esta expresión es necesaria para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de CME. Para estudiarla, nos propusimos como primer objetivo analizar la unión de los FT en la región promotora de Myst4 mediante estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP-seq) disponibles en bases de datos. Luego, analizamos el patrón de expresión de Myst4 en CME de ratón indiferenciadas y en diferentes etapas de distintos protocolos de diferenciación, tanto en ensayos generados en nuestro laboratorio como en datos de diferenciaciones disponibles de forma abierta. Posteriormente, estudiamos la regulación de Myst4 por los FT esenciales mediante un abordaje de silenciamiento de estos factores en CME. En este trabajo de tesis, observamos que Myst4 se expresa en CME de ratón y que es reprimido durante la diferenciación hacia cualquier tipo celular. Además, nuestros resultados sugieren que su expresión podría estar regulada por Nanog y Oct4, tanto por su posicionamiento en la región regulatoria de Myst4 como por su represión cuando cualquiera de estos dos factores es silenciado. Para estudiar la relevancia de Myst4 sobre el mantenimiento de las propiedades de células madre, utilizamos en primer lugar la estrategia de silenciamiento por shRNA. Sin embargo, ninguno de los tres shRNA ensayados logró un silenciamiento consistente en la expresión de este remodelador. Posteriormente, decidimos utilizar la estrategia de CRISPR/Cas9 para generar líneas celulares de CME knockout para Myst4 (W4 M4-/-). Esta línea no presentó diferencias significativas con respecto a la línea wild type en los niveles de marcadores de pluripotencia y diferenciación temprana. Sin embargo, observamos un cambio en la morfología de las colonias formadas por las células en estado indiferenciado, siendo las mutantes menos refringentes y más planas que las wild type. Por otro lado, las células W4 M4-/- mostraron un mayor número de células cuando se diferenciaron hacia progenitores neurales. Además, este aumento se vió acompañado por una disminución del marcador de progenitor neural Sox1 y el aumento del marcador de mesodermo Brachyury. Estos resultados sugieren que la línea con ausencia de Myst4 presenta una disminución en la eficiencia de diferenciación neural. Los resultados encontrados en este trabajo de tesis sugieren que Myst4 cumple una función en la diferenciación de CME. Nos encontramos analizando la relevancia de Myst4 en la proliferación y la apoptosis de CME en la diferenciación hacia progenitores neurales y neuronas. Consideramos que entender los procesos involucrados en la regulación de la estructura de la cromatina en CME es fundamental para su futura aplicación