Actividad del interferón de tipo III contra el virus de la Diarrea Viral Bovina - Quintana, Maria Eugenia (2019)
El Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) representa un importante desafío a nivel productivo debido a su carácter endémico prácticamente a nivel mundial. La infección por el VDVB es altamente prevalente en la Argentina provocando pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera, asociadas mayormente a problemas reproductivos. La enfermedad provocada por el VDVB se presenta con una variada signología que puede ir desde un curso subclínico a cuadros agudos hemorrágicos cuyo desenlace suele ser fatal. A esto se suma el efecto inmunosupresor del VDVB que predispone a infecciones bacterianas y parasitarias que pueden comprometer la vida del animal. El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, género Pestivirus y está representado por 3 genotipos: VDVB-1, VDVB-2 y VDVB-3 o “Virus HoBi-like”. A su vez, este agente puede ser clasificado según su biotipo en citopático (CP) y no citopático (NCP). Una característica fundamental del VDVB es su capacidad de generar infecciones persistentes. El nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) tiene lugar cuando las hembras preñadas se infectan con una cepa NCP del VDVB entre los días 30 y 150 de gestación. Estos individuos no son capaces de montar una respuesta inmune y eliminan grandes cantidades de virus en todas las excreciones y secreciones. Actualmente se proponen dos medidas principales para el control de la enfermedad: la detección y eliminación de animales PI, y la posterior vacunación de todo el rodeo no PI. La primera medida es recibida con fuerte resistencia por parte de los productores. Por otro lado, la inmunidad que confieren las vacunas que se encuentran en el mercado requiere más de dos semanas para desarrollarse e incluso de más de una dosis, siendo dudosa su eficacia en presencia de inmunidad materna. A estos inconvenientes se suma que la mayoría de las formulaciones comerciales no brindan cobertura contra todas las cepas del virus que circulan en el campo. Para complementar el conjunto de herramientas para el control del VDVB se precisan antivirales que puedan prevenir la dispersión viral, evitando la inmunosupresión. Los antivirales podrían utilizarse en casos de brotes o como preventivo antes de ciertas maniobras como el transporte, encierro, inseminaciones, introducción de nuevos animales, etc. En este trabajo proponemos el uso de Interferones (IFNs) ya que son antivirales naturales, de sencilla producción y amplio espectro. En contraste con la respuesta inmune adaptativa, los mecanismos innatos de defensa inmune mediados por IFN son inmediatos, y resultan operativos incluso en las primeras etapas de desarrollo intrauterino. La administración de IFN como agentes bioterapéuticos es una medida efectiva para el tratamiento de varias infecciones virales. Tradicionalmente en terapias desarrolladas para humanos se han utilizado IFN de tipo I (IFN-α) que están siendo actualmente reemplazados, dada su toxicidad hematológica, por los IFN de tipo III (IFN-λ), cuyo efecto antiviral es idéntico al IFN-α pero localizado en epitelios, principalmente en mucosas, sin efecto sobre las células sanguíneas. La familia de IFN-λ se encuentra conservada en bovinos y el tratamiento con IFN-λ3 ha mostrado ser eficaz en controlar la infección oronasal por el virus de la fiebre aftosa (VFA). No se ha estudiado la aplicación terapéutica ni la funcionalidad del IFN-λ3 a otros virus que afectan la producción ganadera. Este trabajo plantea las siguientes hipótesis: “El IFN-λ3 bovino posee actividad antiviral contra el VDVB”; y “El IFN-λ3 bovino recombinante es un candidato para ser utilizado como bioterapéutico en infecciones con el VDVB”. Para contrastar estas hipótesis, hemos clonado y expresado el INF-λ3 y el IFN-α bovinos en células de mamífero en cultivo y evaluamos su actividad antiviral frente a distintas cepas del VDVB tanto in vitro como in vivo para comprobar su potencial uso como bioterapéutico en bovinos. Los IFN recombinantes (IFNr) producidos en sobrenadantes de células HEK293T transfectadas fueron cuantificados en función a las unidades activas determinadas sobre virus de referencia y utilizando un ensayo reportero de actividad basado en células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) transfectadas en forma estable con un promotor MxA río arriba del ORF para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Para establecer la sensibilidad de cepas de campo y de referencia del VDVB a los IFNr, desarrollamos una técnica de alto rendimiento aplicable a cepas CP y NPC. Se trata de un ELISA en células que permite la medición directa de la infección detectando una proteína no estructural del virus en microplacas de cultivo celular, sin necesidad de cosechar las células. Utilizando este ensayo estimamos la concentración inhibitoria 50% para cada IFNr utilizando seis cepas de VDVB de diferente biotipo y genotipo, verificando que las cepas CP son más susceptibles a ambos IFNr que las NCP y, particularmente, las cepas NCP de tipo 2 resultaron más sensibles a IFN-λ. La actividad de los IFNr fue evaluada luego in vivo, en un modelo murino de virulencia desarrollado en nuestro laboratorio, en el que ratones de la cepa BALB/c infectados con cepas del tipo 2 del VDVB desarrollan viremia a los 4 ó 7 días post infección (dpi), según la virulencia de la cepa. La cepa de alta virulencia suprimió además la respuesta proinflamatoria en estos animales. El tratamiento de los ratones con IFNr murinos comerciales mostró que el IFN-λ sería más eficiente en prevenir la infección mientras que el IFN-α evitaría la viremia. Experimentos de tratamiento combinado con dos dosis de antiviral pre-y post infección, combinando el uso de ambos IFNs, reveló que el tratamiento con IFN-λ antes de la infección seguido luego por IFN-α fue efectivo en controlar la viremia en los ratones, y que un tratamiento pre y post-infección con IFN-λ resultaba igualmente protector. La limitación de la replicación del VDVB se verificó además por la ausencia de TNF-α sistémico. Estos resultados entonces indicaban que el IFN-λ resultaba efectivo contra el VDVB in vivo, y que no sería preciso combinarlo con IFN-α. Para evaluar el uso de nuestros IFNr en bovinos establecimos primero la inocuidad de los mismos sobre células sanguíneas bovinas (ex vivo) donde ambos IFN mostraron ser seguros a las dosis de uso propuestas, a pesar de que el IFN-α causó apoptosis de células inmunes bovinas a dosis altas. La inocuidad posológica se realizó directamente en los animales mediante el control de parámetros hematológicos durante 14 días postinoculación, revelando la ausencia de toxicidad con dosis de IFN-λr más altas. A partir de estos resultados se realizó una prueba de concepto en terneros para evaluar la actividad antiviral del IFN-λr frente a la infección con una cepa de baja virulencia aislada en la provincia de Buenos Aires, del genotipo 2 y biotipo NCP, ampliamente caracterizada en nuestro laboratorio. Se seleccionaron para el estudio 6 terneras libres del VDVB, que fueron infectadas con la cepa antedicha. Cuatro de ellas fueron inoculadas por vía subcutánea con dos dosis de IFN-λr dos días previos a la infección y dos días posteriores a la misma, mientras que las otras dos terneras recibieron tratamiento placebo (medio de dilución). Los animales infectados-no tratados desarrollaron enfermedad clínica con síntomas respiratorios entre los 2 a 4 días post-infección, detectándose también viremia y excreción viral a través de secreciones nasales. Todos los animales del grupo tratado con IFN-λr no desarrollaron enfermedad, no presentaron signos clínicos. En tres de ellos no de detectó viremia ni excreción viral nasal. Un individuo de este último grupo presentó viremia y excreción viral pero con valores menores a los del grupo no tratado. Hemos desarrollado un antiviral seguro y eficaz, IFN-λ bovino recombinante, demostrando la factibilidad de su potencial utilización para la prevención y el tratamiento de las infecciones por el VDVB. Comprobamos el efecto antiviral del IFN-λr sobre cepas de campo y de referencia in vitro, como así también su inocuidad y eficacia en bovinos contra una cepa de campo Argentina del genotipo 2, biotipo NCP. Hemos establecido el modelo ratón de viremia por el VDVB, de gran utilidad para los estudios con este virus in vivo. Desarrollamos una técnica novedosa, que consiste en un ELISA en células que utiliza un anticuerpo detector contra una proteína conservada no estructural que puede ser potencialmente aplicable para medir con precisión la infectividad de cualquier cepa viral, independientemente de su capacidad de causar la muerte de células en cultivo. Este trabajo constituye la primera evidencia experimental del potencial bioterapéutico del IFN-λ bovino contra el VDVB in vivo, abriendo una nueva perspectiva enfocada en el uso de antivirales biológicos económicos, biodegradables y seguros para reducir la incidencia de las infecciones virales en animales en ámbitos productivos. La aplicación de esta herramienta podría impactar indirectamente en la disminución del uso de antibióticos al decrecer la tasa de infecciones bacterianas que devienen de las infecciones virales inmunosupresoras.