Caracterización funcional de factores implicados en la protección frente al daño por frío en frutos de durazno - Gismondi, Mauro (2018)
Los frutos de duraznero (Prunus persica L. Batsch) y de otras especies de la familia Rosaceae poseen gran importancia agronómica y nutricional. Debido a que su labilidad aumenta rápidamente a temperatura ambiente, el uso de bajas temperaturas (R) es una práctica indispensable para extender su vida comercial. Sin embargo, la fruta se ve afectada por problemas fisiológicos asociados a la refrigeración, conocidos bajo la denominación de daño por frío (CI, chilling injury) y evidenciados al momento del consumo. La aplicación de tratamientos térmicos (TT), entre otros procedimientos poscosecha, ha sido empleada como estrategia para prevenir los síntomas de este desorden, preservando calidad organoléptica y valor nutricional. Adicionalmente, la gran diversidad varietal y su investigación ofrecen importantes herramientas para enfrentar este tipo de problemas productivos. En la actualidad se desconocen en detalle los mecanismos moleculares asociados al daño por frío y a su protección; y, con el fin de identificar determinantes moleculares involucrados en ambos procesos, nuestro grupo ha empleado diversos enfoques ómicos. Transcriptomas, proteomas (total y de apoplasto), metabolomas y lipidoma se han identificado diferencialmente en frutos cv. Dixiland bajo tratamiento térmico y en frutos expuestos a refrigeración de variedades con constrastante susceptibilidad al CI. De esta manera, variadas moléculas se identificaron como putativas protectoras frente a estos desórdenes, siendo fundamental un análisis funcional de las mismas. En la presente tesis, se decidió combinar conocimientos y métodos de biología molecular y bioinformática para identificar y validar determinantes implicados en la protección frente a CI, generando nuevas herramientas que faciliten la búsqueda de variedades de durazno que produzcan frutos con menor susceptibilidad a problemas poscosecha relacionados con dicho daño. Una nueva base de genes de durazno fue creada a partir de las moléculas identificadas por nuestro grupo, con los datos de expresión obtenidos, anotaciones e información derivada de investigaciones con sus ortólogos en otras frutas. Los rasgos de secuencias regulatorias transcripcionales de estos genes de respuesta a TT y/o R fueron analizados en profundidad en cuanto a su contenido, enriquecimiento y arreglo de elementos cis mediante un software de diseño propio, con el fin de definir familias de factores de transcripción putativamente implicadas en los procesos bajo estudio. Elementos cis conocidos en otras especies vegetales, de respuesta a estímulos de temperatura (entre otros) fueron identificados conservados en grupos de promotores coregulados y subgrupos de genes de interés pudieron definirse, permitiendo establecer nuevos actores e hipótesis para descifrar mecanismos subyacentes a las respuestas a temperatura durante la poscosecha. Por otro lado, hemos progresado hacia la caracterización bioinformática y funcional de dos genes reguladores, posiblemente candidatos de la protección frente al daño por frío e identificados previamente. PpZAT12 codifica para un factor de transcripción con dedos de zinc (ZF) de la familia C2H2, como el marcador de estrés sistémico AtZAT12, de la especie modelo Arabidopsis thaliana. Los niveles del ARNm PpZAT12 fueron verificados inducidos luego de TT y al aplicar refrigeración, particularmente en frutos de variedades resistentes al CI. Análisis in silico de las regiones regulatorias permitieron identificar elementos cis clave que condicen con la expresión génica observada, con su participación en múltiples estímulos y a su vez delinean reguladores upstream de ambos transcriptos ortólogos, aunque adicionalmente se identificaron diferencias. Líneas transgénicas 35S::AtZAT12, 35S::PpZAT12 y 35S::PpZAT12/KO-AtZAT12 de A. thaliana presentaron crecimiento y desarrollo retardados, rindiendo plantas de menor tamaño, con floración retrasada y otros rasgos fenotípicos interesantes como presencia de múltiples hojas de roseta curvadas. La regulación de posibles genes target de AtZAT12 en A. thaliana fue confirmada en los genotipos mencionados, por parte de los ortólogos ZAT12. Adicionalmente, un enfoque proteómico fue aplicado para caracterizar péptidos de presencia diferencial en hojas de plantas en floración de los distintos genotipos e implicados en las diferencias fenotípicas observadas. Finalmente, se analizó y definió comparativamente un regulón putativo de ambas proteínas ZAT12. Estos resultados sugieren que el FT PpZAT12 llevaría a cabo un rol protector frente al CI e incluso podría contribuir a los efectos benéficos del TT en duraznos, exhibiendo funcionalidad/es molecular/es similar/es a aquellas de su ortólogo AtZAT12, en A. thaliana. El ARNm PpTRAF, que codifica para una proteína de función desconocida con ZFs tipo TRAF (Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor), pertenece a los transcriptos diferencialmente inducidos en duraznos luego de TT. Se observaron niveles aumentados del mismo luego del almacenamiento refrigerado y se determinó su presencia en otros órganos de duraznero. La localización subcelular del producto génico PpTRAF fue determinada nuclear y citosólica mediante fusión traduccional al reportero fluorescente CFP y agrotransformación transitoria en hojas de N. benthamiana y estable en A. thaliana. Dos ensayos de complementación in vivo en cepas de E. coli particulares fueron utilizados para verificar su funcionalidad como ARN chaperona a bajas temperaturas y actividad de anti-terminación de la transcripción, destacando su posible participación en el metabolismo de ARN vegetal. A modo de profundizar estos estudios, el órtologo de PpTRAF en A. thaliana, AtTRAF, fue caracterizado comprobándose similitudes importantes en cuanto a su localización y funcionalidad como ARN chaperona, respecto a su ortólogo de duraznos. Genotipos con ganancia y pérdida de función de AtTRAF fueron obtenidos y fenotipados en relación a sus respuestas frente estímulos de temperatura y otros de interés. Se verificaron un comportamiento positivo en la velocidad de elongación de raíces y uno negativo en la germinación frente a bajas temperaturas para el genotipo mutante KO-AtTRAF respecto a Col-0, mientras que las líneas 35S::AtTRAF respondieron de forma opuesta bajo las mismas condiciones. Adicionalmente, KO-AtTRAF demostró un comportamiento similar luego del estímulo por la fitohormona ABA. Estos resultados sugieren que PpTRAF y AtTRAF poseen una nueva arquitectura con rol ARN chaperona, sumando a la diversidad estructural y de mecanismos de acción de este grupo heterogéneo de proteínas. Los rasgos conservados entre estos ortólogos de P. persica y A. thaliana, sugieren la importancia de su participación en el metabolismo del ARN en diversas respuestas vegetales y de diferentes órganos a la temperatura, incluidas el daño por frío y su protección en frutos de durazno. A modo de conclusión general, los resultados obtenidos en la presente tesis sugieren que procesos moleculares conservados pueden desarrollarse en respuesta a estímulos de temperatura en frutos de P. persica y diversos órganos de A. thaliana, permitiendo a las células aclimatarse y/o resistir en contra de desórdenes agronómicos indeseados como el daño por frío.