Estudio del sistema de SUMOilación en Trypanosoma brucei - Iribarren, Paula Ana (2016)
La SUMOilación es una modificación post-traduccional de proteínas exclusiva de eucariotas, intensamente estudiada en la actualidad. Esta modificación consiste en la unión covalente de una proteína con homología estructural a ubiquitina, llamada SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), a un residuo de lisina de la proteína blanco, alterando su superficie de interacción y afectando así su localización, estabilidad, actividad y/o interacción con otras proteínas. Normalmente sólo un bajo porcentaje de una proteína se encuentra SUMOilada en un momento dado y el efecto que esta modificación ejerce en ella no puede ser predicho a priori. La SUMOilación es una modificación dinámica y reversible, asociada a muchos procesos celulares como replicación y reparación del ADN, remodelación de la cromatina, segregación cromosómica, metabolismo del ARN, transporte núcleo-citoplasma, etc. De hecho, la SUMOilación ha demostrado ser esencial en muchos organismos, incluyendo nuestro modelo de estudio, Trypanosoma brucei. T. brucei es un parásito extracelular de la familia Trypanosomatidae responsable de la tripanosomiasis africana o enfermedad del sueño en humanos y del Nagana en ganado. Estas enfermedades son endémicas del continente africano, lugar de residencia de su insecto vector: la mosca del género Glossina (tse-tse). El ciclo de vida de este kinetoplástido alterna entre formas replicativas y no replicativas ya sea dentro del hospedador mamífero como del insecto vector, pero sólo dos de ellas, la forma procíclica (intestino de la mosca) y sanguínea alargada (sangre/líquidos tisulares del mamífero) son cultivables de manera axénica en el laboratorio. T. brucei presenta un mecanismo sofisticado de variación antigénica que le permite evadir la respuesta inmune humoral montada por el hospedador contra su principal glicoproteína de superficie (VSG). Recientemente, este proceso ha sido asociado de manera directa con la SUMOilación de proteínas aún no caracterizadas. Considerando la relevancia de esta modificación post-traduccional en este trabajo de Tesis nos propusimos identificar de manera global proteínas SUMOiladas en el parásito. Para llevar esto a cabo, desarrollamos líneas transgénicas de parásitos procíclicos y sanguíneos en las que los dos alelos que codifican para TbSUMO fueron reemplazados por variantes etiquetadas para permitir la purificación de proteínas SUMOiladas en base a diferentes principios de afinidad y posterior identificación por espectrometría de masas. Estas líneas celulares nos permitieron validar la funcionalidad de las etiquetas empleadas pero las proteínas SUMOiladas no pudieron ser enriquecidas significativamente por sobre los contaminantes de la purificación. Las líneas transgénicas desarrolladas a continuación expresaron exclusivamente una versión de TbSUMO etiquetada en su extremo N-terminal y deficiente en residuos de lisina, reduciendo la co-purificación de proteínas contaminantes tras digestión con la endoproteasa Lys-C. Esta estrategia permitió la identificación de un número reducido de proteínas SUMOiladas. Sin embargo resultó de utilidad para demostrar que las cadenas de poliSUMO no serían esenciales para la viabilidad del parásito. Para optimizar los resultados obtenidos implementamos finalmente una estrategia recientemente descripta en la que expresamos una variante de TbSUMO que posee etiquetas para la detección y purificación de conjugados en su extremo N-terminal y una mutación cercana a su extremo C-terminal T106K. Esta modificación genera un sitio de clivado para la enzima Lys-C permitiendo que un fragmento de TbSUMO de solo 114 Da (motivo diglicina) permanezca unido al péptido modificado tras la digestión con la enzima. Tras un paso de enriquecimiento con anticuerpos anti diglicina, estos péptidos pequeños en forma de T pueden ser identificados por espectrometría de masas. De esta manera es posible realizar la identificación de las proteínas SUMOiladas y sus sitios de SUMOilación en un mismo experimento de proteómica. Siguiendo esta metodología pudimos identificar en parásitos procíclicos 52 sitios de SUMOilación en 44 proteínas de manera confiable, muchas de ellas asociadas a procesos de replicación y reparación del ADN, procesamiento y degradación del ARN, etc. Estos resultados en conjunto permiten evidenciar el rol de este modificador en la regulación de muchos `procesos fisiológicos relevantes para T. brucei. Para el estudio posterior de las proteínas SUMOiladas de interés desarrollamos también un sistema de SUMOilación específico para T. brucei en un sistema heterólogo bacteriano. Dado que la maquinaria de SUMOilación se encuentra ausente en procariotas, co-expresamos en E. coli las enzimas TbE1a, TbE1b, TbE2 y TbSUMO con etiquetas apropiadas en dos vectores compatibles de la serie Duet (pCDFDuet-1-TbSUMO-TbE2 y pACYCDuet-1-TbE1a-TbE1b). La proteína a SUMOilar fue co-expresada en el sistema completo con una etiqueta en su extremo C-terminal, para evaluar su patrón de modificación por Western blot en extractos bacterianos solubles. Esta estrategia nos permitió describir la formación de cadenas de poliSUMO in vitro y evaluar la SUMOilación de un sustrato modelo, como PCNA de Saccharomyces cerevisiae. Para validar la modificación de esta proteína blanco realizamos ensayos de deconjugación in vitro empleando la proteasa recombinante TbSENP. Esta proteasa específica de T. brucei permite revertir el patrón de SUMOilación del sustrato observado por Western blot. Este sistema sencillo y versátil constituye una herramienta fundamental para la validación de potenciales sustratos de SUMOilación, generación de mutantes, estudios funcionales y determinación de sitios de SUMOilación.