Optimización de las condiciones de reacción de Fenilalanina amonio liasa empleando un hidrolizado de proteína como substrato modelo - Castañeda, María Teresita (2014)
Introducción L-Fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.25) cataliza la bioconversión de L-fenilalanina (L-Phe) en ácido t-cinámico (t-CA) y amoníaco. Esta enzima fue descripta por primera vez in plantas superiores, donde su función se la asociaba a mecanismos de defensa. Unos años después pudo ser aislada en algunos microorganismos, en especial en levaduras del género Rhodotorula. Dentro de este género, Rhodosporidium toruloides NBRC 0559 fue la cepa que evidenció mayor actividad PAL cuando fue cultivada en un medio conteniendo L-fenilalanina como inductor. PAL ha sido producida, purificada y caracterizada en una amplia gama de plantas y algunos microorganismos. En los últimos años, PAL ha despertado interés por su potencial uso en el tratamiento de la fenilcetonuria (PKU), enfermedad congénita caracterizada por la deficiencia de la enzima metabólica L-fenilalanina hidroxilasa (PAH, EC. 1.14.16.1), la cual cataliza la conversión de fenilalanina en tirosina. En los pacientes con PKU, la fenilalanina se acumula en el torrente sanguíneo produciendo graves trastornos a nivel del sistema nervioso central. Actualmente, el único tratamiento posible consiste en la ingesta de alimentos con escaso o nulo contenido de fenilalanina. Estudios anteriores han determinado cuales son los parámetros óptimos para la reacción de PAL purificada con L-fenilalanina como substrato. En general estos parámetros dependen esencialmente del origen de la enzima, ya sea microorganismo o planta. El objetivo de este trabajo es determinar los parámetros óptimos de reacción de PAL con un substrato complejo empleado como modelo, en este caso, un hidrolizado ácido de caseína. Metodología PAL producida a partir de R. toruloides fue aislada y parcialmente purificada, siguiendo los lineamientos de Adachi y col. (1990). Dicha enzima fue empleada en el tratamiento de un hidrolizado ácido de caseína (CAH, OXOID L41, AN/TN = 64%, L-Phe ~ 2,28 % p/p), con la finalidad de reducir el contenido de L-fenilalanina. Las condiciones de reacción fueron optimizadas en términos de: concentración de substrato (0-50 g/l), concentración de enzima (0 - 280 mU/ml), pH (7 - 9) y temperatura (30 - 70ºC), mediante el empleo de sucesivas superficies respuesta, por medio del diseño hexagonal de Doehlert. Para describir la respuesta observada, se empleó un modelo cuadrático, cuyos coeficientes fueron calculados mediante ANOVA. Z= β_0+∑_(i=1)^k▒〖β_(i ) X_i+〗 ∑_(i=1)^k▒〖β_ii X_i^2+∑_(i=1)^k▒∑_(i=1)^L▒〖β_ij X_i X_j 〗〗 Una vez que los parámetros fueron optimizados, se determinó la cinética de reacción de la enzima con CAH como substrato, bajo dichas condiciones. Con la finalidad de medir la actividad enzimática empleando un sustrato complejo, se desarrolló una metodología alternativa al método tradicional. Para ello, la muestra es disuelta en buffer Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) con 5 mM 2NaEDTA para luego ser tratada con la enzima a 30°C. La reacción es detenida a diferentes tiempos mediante el agregado de un volumen igual al 10 % (v/v) de una solución concentrada de ácido tricloroacético (TCA, 20 % p/v). Seguidamente la muestra es centrifugada a 10.000 rpm por 10 min y el ácido t-cinámico, resultante de la bioconversión de fenilalanina, es aislado mediante extracción con solvente, empleando acetato de etilo en proporción 20 : 1. Finalmente el t-CA en la fase orgánica es medido espectrofotométricamente a 290 nm (DO290). La PAL producida por R. toruloides puede emplear alternativamente tirosina como substrato, produciendo ácido p-cumárico que absorbe a una longitud de onda muy cercana al ácido t-cinámico. Por ello fue requerida la validación de los resultados mediante HPLC. Resultados Las concentraciones de enzima y sustrato fueron optimizadas en relación a la actividad PAL, empleando diseños de superficie respuesta. A partir del análisis ANOVA, ambos parámetros resultaros estadísticamente significativos (<0,05) en la actividad PAL (R2 = 98,2 %). Como es de esperar, la DO290 aumenta proporcionalmente a los incrementos de concentración de sustrato, hasta valores cercanos a los límites de solubilidad (50 g/l p/v). Luego, para dicha concentración de CAH (35 g/l), se ensayaron incrementos sucesivos de enzima, hasta que el sistema se saturó a concentraciones de PAL de 800 mU/ml. Por otro lado, la temperatura y el pH fueron igualmente optimizados, resultando ambos estadísticamente significativos en la actividad PAL (R2 = 98 %). A partir del cálculo de los efectos se pudo determinar que la temperatura tiene efecto negativo sobre la actividad PAL (en especial a partir de los 50°C), mientras que el pH tiene efecto positivo, aumentando la actividad PAL con el incremento del pH. Los valores óptimos se alcanzaron para temperaturas entre 40°C y 45°C, y pH entre 8,2 y 8,7. Finalmente, tras comparar las variables de proceso (pH y temperatura) con las condiciones óptimas descriptas para PAL con L-fenilalanina como substrato, se alcanzó un incremento de más del 100 % en la actividad PAL. Bajo estas condiciones, la cinética de reacción es linear en las primeras 6 h de tratamiento, logrando reducir el contenido de fenilalanina, como puede ser evidenciado en las determinaciones por HPLC. Conclusión En este estudio se llevó a cabo la optimización de las variables de reacción de CAH con PAL, empleando diseños de superficie respuesta. Mediante esta optimización, se logró incrementarse la actividad PAL en un 100%. En estas condiciones la cinética es linear en las primeras horas de reacción, logrando una disminución substancial del contenido de fenilalanina, como pudo evidenciarse en los cromatogramas obtenidos por HPLC. El producto obtenido de este modo, puede considerarse apto para ser incorporado en la dieta de pacientes con fenilcetonuria.