Caracterización molecular del virus asociado a la enfermedad azul atípica del algodón y estudio del quiebre de al resistencia - Agrofoglio, Yamila Carla (2017)
En las campañas algodoneras 2009-2010 en varias regiones de la provincia de Chaco se detectó una virosis en cultivares de algodón resistentes al cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), que producía leve enrollamiento de las hojas y desregulaba la dominancia apical sin afectar la altura de la planta. Se tomaron muestras de plantas de un cultivar resistente (aislamiento M3) y uno susceptible (aislamiento M5) al CLRDV que presentaban la nueva sintomatología y se realizaron ensayos de PCR con primers diagnósticos para tres familias virales que infectan algodón: Luteoviridae, Geminiviridae y Bromoviridae. Además, se usaron primers diagnóstico para la familia Potyviridae ya que son capaces de infectar a más de 200 especies vegetales. Las muestras resultaron positivas cuando se analizó al grupo taxonómico de los Luteoviridae, indicando que el virus desconocido pertenece a esta familia y descartando, en principio, una coinfección con virus conocidos. Se secuenció la región amplificada de 1065 pb y se observó alta identidad de secuencia, tanto en nucleótidos como en aminoácidos, con el CLRDV. En el presente trabajo se completó la secuenciación de ambos aislamientos y se analizó su organización genómica. Ambos genomas virales resultaron de una longitud de 5.866 nucleótidos, presentaron la organización típica de los Polerovirus y se identificaron siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Se analizaron las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de ambos aislamientos y las diferencias encontradas entre sí fueron menores al 2%, concluyendo que corresponden a una misma cepa viral. Por otro lado, las proteínas de ambos aislamientos mostraron una identidad de secuencia que variaba entre el 88% y el 98% con respecto a las correspondientes proteínas codificadas por el CLRDV. A pesar que el International Committe on Taxomy of Viruses (ICTV) establece que diferencias mayores al 10% en cualquier producto génico son suficientes para definir una nueva especie dentro del género Polerovirus, los aislamientos M3 y M5 sólo mostraron una baja identidad en la secuencia de la proteína más variable entre las especies del género (proteína P0). Por ese motivo, consideramos que ambos aislamiento corresponden a una cepa atípica del CLRDV, CLRDV-at, que produce distinta sintomatología y es capaz de quebrar la resistencia presente en el germoplasma de algodón que se siembra localmente. Se estudió el origen evolutivo del CLRDV-at con respecto a otras especies de la familia Luteoviridae. Para ello, se construyeron árboles filogenéticos utilizando las secuencias de aminoácidos de la proteína P0, supresor de silenciamiento génico, y la proteína P3, correspondiente a la cápside viral. En ambos dendogramas, los dos aislamientos de CLRDV-at se agruparon en un mismo cluster separados de los aislamientos brasileros del CLRDV y del aislamiento argentino de CLRDV. Con el objetivo de confirmar que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector Aphis gossypii, se tomó una colonia de áfidos de una planta de algodón resistente a enfermedad azul y con síntomas de CLRDV-at y se transfirieron a plantas de algodón de la variedad NuOpal (resistente a CLRDV) y al cabo de 3 semanas se observaron los primeros síntomas de la enfermedad. La presencia del virus fue analizada mediante RT-PCR y posterior secuenciación, confirmando que el CLRDV-at es transmitido por el insecto vector A. gossypii. Con el objetivo de caracterizar al CLRDV-at a nivel molecular y biológico se construyó un clon infectivo de cDNA del virus. El clon infectivo permitió la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector. Se infectaron distintas variedades de G. hirsutum resistentes y susceptibles a CLRDV y 3 semanas postinfección, las plantas desarrollaron hojas en las yemas laterales, las nervaduras se curvaron y las hojas adquirieron una coloración verde oscura. El RNA viral fue detectado en las hojas sistémicas mediante RT-PCR y Northern blot, confirmando la funcionalidad del clon infectivo. Dado que los síntomas no se correspondían completamente con los observados en el campo y con la premisa de que la enfermedad se manifiesta al final del ciclo del cultivo, se infectaron plantas con cuatro meses de desarrollo con el clon infectivo del CLRDV-at. Los síntomas característicos de la enfermedad a campo se observaron a las 3 semanas postinfección y la infección fue confirmada por RT-PCR. En el género Polerovirus, la proteína P0 fue inicialmente descripta como un factor de patogenicidad y recientemente fue caracterizada como supresor del silenciamiento del RNA. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del turnip yellow virus (TuYV), en la planta modelo A. thaliana, está dada por la interacción con las proteínas ASK1 y ASK2. ASK1 y ASK2 son componentes del complejo SKP1-Cullin F-Box (SCF) y pertenecen a la familia de proteínas E3 ubiquitin ligasas. Cuando se produce la interacción del complejo SCF con P0, la proteína Argonauta 1 (AGO1) de la vía del silenciamiento de la planta es ubiquitinilada y degradada por una vía dependiente de autofagia. La interacción ocurre a través del dominio F-Box (LPXXL/IX(10-13)P) que poseen las proteínas P0, y que está presente en el P0 del CLRDV, y parcialmente en CLRDV-at, donde se encuentra mutado el aminoácido Leucina (L) por el aminoácido Valina (V), perdiendo, en parte, el dominio consenso. Para analizar si la proteína P0 del CLRDV-at (P0CLR-at) posee actividad supresora de silenciamiento génico al igual que la proteína P0 del CLRDV (P0CLR), se utilizaron dos sistemas experimentales que permitieron obtener diferente información acerca del mecanismo de supresión. En el primer sistema se evaluó la capacidad de la proteína P0 de inhibir el silenciamiento génico gatillado al agroinfiltrar una segunda copia del transgén de la proteína verde fluorescente de aguaviva (GFP) en la línea 16c de N. benthamiana (expresa la proteína GFP en forma constitutiva) y en el segundo sistema, se estudió la capacidad de la proteína P0 de suprimir el silenciamiento del RNA disparado por secuencias de RNA doble cadena (dsRNA). En ambos sistemas se observó que la proteína P0CLR-at posee actividad supresora del silenciamiento local, aunque su actividad es más suave que la observada en la proteína P0CLR y al igual que esta última, no posee actividad supresora del silenciamiento sistémico. También, se demostró que la proteína P0CLR-at es capaz de interactuar con la proteína SKP y GSK (ortólogos de ASK en N. benthamiana y G. hirsutum) y esa interacción conlleva a la desestabilización de la proteína AGO1. Se ha demostrado que la actividad supresora del silenciamiento de la proteína P0 del TuYV (P0Tu) es menor cuando se realiza el ensayo de supresión con el clon infectivo del virus, posiblemente porque P0Tu presenta niveles muy bajos de expresión durante la infección viral. Para evaluar si P0CLR-at también posee la misma actividad supresora de silenciamiento en el contexto de la infección viral, se realizaron ensayos de coinfiltración, como los mencionados anteriormente, pero utilizando en este caso el clon infectivo de cDNA del CLRDV-at. Cabe destacar que el clon infectivo mostró una mayor actividad supresora con respecto a la observada cuando se expresa P0CLR-at sola, lo que probablemente se deba a que la proteína P0CLR-at es más estable en el contexto de la infección viral, o bien a que el virus posee otra proteína con actividad supresora del silenciamiento. También se estudió la patogenicidad de la proteína P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo, como es el sistema de PVX. Se infectaron plantas N. benthamiana y se observó que las construcciones PVX-P0CLR y PVX-P0CLR-at producían una exacerbación de los síntomas de infección con respecto al PVX wild type pero el PVX-P0CLR-at desarrollaba síntomas más suaves de infección con respecto al PVX-P0CLR. Estos ensayos nos permitieron concluir que las proteínas P0CLR-at y P0CLR no sólo poseen diferencias en su actividad supresora del silenciamiento, sino también en la severidad de los síntomas que producen. A pesar de la alta identidad de secuencia entre CLRDV y CLRDV-at, ambos virus producen distintos síntomas y el CLRDV-at es capaz de sobrepasar la resistencia a CLRDV de las variedades de algodón. Con el objetivo de identificar la(s) proteína(s) responsable(s) del quiebre de la resistencia y del cambio de la sintomatología, se reemplazaron la proteína P4, implicada en el movimiento viral de célula-célula, y la proteína P0 del CLRDV-at en forma individual en el clon infectivo del CLRDV, que estaba disponible en el laboratorio, dando a lugar a las construcciones quiméricas: 35S/CLRDV-MPCLR-at y 35S/CLRDV-P0CLR-at, respectivamente. La construcción 35S/CLRDV-MPCLR-at no fue capaz de infectar plantas de cultivares resistentes a CLRDV, mostrando que esta proteína por sí sola no logra sobrepasar la resistencia; sin embargo, se observó una disminución en la severidad de los síntomas con respecto a las plantas inoculadas con el clon infectivo del CLRDV. La construcción 35S/CLRDV-P0CLR-at logró establecer la infección en variedades de algodón resistentes al CLRDV y los síntomas observados correspondieron a los del CLRDV-at, indicando que la proteína P0 sería la responsable de sobrepasar la resistencia y del cambio de síntomas. Los resultados del presente trabajo de tesis permitieron la caracterización de una nueva variante del virus cotton leafroll dwarf virus, CLRDV-at, que causa la enfermedad azul atípica del algodón, se identificó el insecto vector y la proteína responsable del desarrollo de síntomas y el quiebre de la resistencia. Además, se construyó un clon infectivo de cDNA, que permitirá acelerar la búsqueda de germoplasma resistente en los programas de mejoramiento de algodón.