Relevancia de la expresión de Tristetraprolina (TTP) en el mantenimiento del compartimento progenitor del epitelio mamario - Stedile, Micaela Nadia (2022)
La estabilidad de los ARN mensajeros (ARNm) está controlada por proteínas que se unen a secuencias enriquecidas en adenina y uracilo (ARE) en sus regiones 3' no traducidas (3'UTR) denominadas colectivamente proteínas de unión a AU (AUBP). Esta Tesis se centra en el análisis del papel biológico en la glándula mamaria de una AUBP en particular llamada Tristetraprolina (TTP). TTP modifica decaimiento de sus transcriptos blanco, muchos de las cuales codifican para citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), pero también para oncoproteínas, como c-Myc, Ciclina D1, VEGF y metaloproteinasas, entre otras. De acuerdo con ello, los niveles de TTP están reducidos en diferentes tipos de tumores, incluido el cáncer de mama, respecto al tejido normal. Comprender la función fisiológica de TTP en la glándula mamaria adulta nos ayudaría a determinar cómo la reducción en su expresión podría facilitar el crecimiento tumoral. En este sentido, nuestro grupo ha demostrado que, en la glándula mamaria, la expresión de TTP está aumentada en ratones hembra durante la lactancia y este efecto puede ser imitado por el tratamiento con prolactina en cultivo celular. En ratones TTP knockout condicionales (MG-TTP KO) obtenidos cruzando ratones TTPfl/fl con animales transgénicos WAP-Cre, hemos determinado que la pérdida de TTP en la glándula mamaria durante la lactancia afecta la alimentación de las crías e induce una involución precoz. Para explorar los resultados de la deficiencia de TTP en etapas tempranas del desarrollo, trasplantamos tejido de glándula mamaria de ratones TTP-KO vírgenes en almohadillas de grasa depletadas de su propio epitelio correspondientes a hembras receptoras wild type (WT). Después de 10 semanas, las hembras trasplantadas con epitelio mamario TTP-KO mostraron una morfogénesis deficiente en comparación con los implantes mamarios control. Estos datos sugirieron un impacto de TTP en las células indiferenciadas que impulsan el desarrollo de la glándula mamaria. En esta Tesis probamos la hipótesis mencionada anteriormente en primer lugar a través de la generación y análisis de una línea celular con menor expresión de TTP (TTP-KD) producida por transfección estable de células epiteliales mamarias HC11 con shRNA específicos para el ARN de TTP. Elegimos esta línea celular porque poseen propiedades stem, similares a las células progenitoras mamarias in vivo. Curiosamente, las células TTP-KD mostraron una reducción en sus tasas de supervivencia, aumento de la apoptosis y niveles incrementados de proteínas pro-apoptóticas como la caspasa 3 clivada (CC3) y BAX. Fenotípicamente, las células TTP-KD revelaron una capacidad disminuida para formar mamosferas en cultivo 3D y repoblar las almohadillas de grasa clareadas de ratones hembra BALB/c vírgenes a 10 semanas post implantación. Estos resultados indican que la muerte celular observada podría haber tenido un impacto significativo en el compartimento de células progenitoras mamarias. Hemos encontrado que las células TTP-KD mostraron una elevada expresión de los mensajeros Il-6 y Tnfα, dos blancos conocidos de TTP que codifican para citoquinas inflamatorias. De forma acorde, estas células presentaron niveles aumentados de fosfo-STAT3 y fosfo-p65 o subunidad RelA de NF-κB, proteínas cuyas vías correspondientes son activadas por IL-6 y TNFα, respectivamente. Ambas vías de señalización están implicadas en la apoptosis y la respuesta inflamatoria en la glándula mamaria. Como se ha reportado previamente, TTP es fosforilada y consecuentemente inactivada por MK2, una proteína río abajo en la vía de p38, la cual es inducida en microambientes estresantes y activada por TNFα. Hemos detectado fosfo-p38 aumentada en células TTP-KD, lo cual además se correlaciona con una actividad de TTP significativamente reducida, medida a través de la transfección transitoria de una construcción que contiene el ADNc de luciferasa río arriba del 3'UTR de Tnfα. Además de la regulación positiva de fosfo-p38, tanto fosfo-ERK1/2 como fosfo-JNK1/2 están disminuidas en las células TTP-KD. Curiosamente, la inhibición farmacológica de p38 mediante el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 redujo los niveles de CC3 y fosfo-p65. Además, el tratamiento de células TTP-KD con SB203580 también restaura la actividad de TTP y la autorrenovación en cultivo 3D. Se lograron efectos similares al agregar Etanercept, un receptor de TNFα soluble que se utiliza para tratar enfermedades inflamatorias. Para abordar cómo la deleción de TTP afecta el potencial de diferenciación de la glándula mamaria durante preñeces sucesivas, aprovechamos nuestros ratones bi-transgénicos WAP- Cre/TTPfl/fl. Se ha demostrado que el promotor WAP no solo es activo en el epitelio mamario durante la lactancia, sino también en las células progenitoras "inducidas por la preñez" (PI-MEC), que participan en el desarrollo ductal y alveolar durante la preñez y la lactancia. Después de dos preñeces, las hembras que carecen de TTP en las células WAP+ mostraron alvéolos dramáticamente subdesarrollados en comparación con las ratonas control, lo que destaca la relevancia de la TTP en la preservación de las células progenitoras mamarias. Además, las glándulas lactantes de WAP-Cre/TTPfl/fl multíparas mostraron niveles incrementados de CC3 y fosfo-p38 en comparación con las ratonas control, lo que presenta semejanza con la línea celular TTP-KD. En resumen, nuestros resultados indican que la expresión de TTP es necesaria para la supervivencia de las células progenitoras mamarias al prevenir eventos proinflamatorios espontáneos y asociados al estrés, que pueden inducir la muerte normal de las células madre mamarias. En las células tumorales mamarias, los mismos efectos, impulsados por la pérdida de TTP, pueden promover la progresión del cáncer de mama y un mal pronóstico para la paciente. Por lo tanto, encontrar estrategias para mantener TTP en niveles de expresión elevados en la glándula mamaria protegería el compartimento progenitor sano y, simultáneamente, evitaría la progresión de las células cancerosas transformadas (fórmula aproximada, revisar la misma en el original).