Avances en la caracterización bioquímica y funcional de los sustratos del sistema de secreción tipo I PrsDE y su efecto en el desarrollo del biofilm de Rhizobium leguminosarum bv....

• Autores: Tarsitano, Julián
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Zorreguieta, Ángeles; Russo, Daniela Marta
• Materia: SISTEMA DE SECRECION TIPO I; DOMINIO CADHERINA LIKE; EXOPOLISACARIDO; BIOFILM; PROTEINA DE UNION A CALCIO; RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM; LECTINA; MATRIZ EXTRACELULAR; GLICANASA; TYPE I PROTEIN SECRETION SYSTEM; CADHERIN-LIKE DOMAIN; EXOPOLYSACCHARIDE; BIOFILM; CALCIUM BINDING PROTEIN; RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM; LECTIN; EXTRACELLULAR MATRIX
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Rhizobium leguminosarum sintetiza un polisacárido acídico secretado mayormente al medio extracelular (EPS) y parcialmente retenido en la superficie bacteriana como polisacárido capsular (CPS). Las proteínas Rap son sustratos del sistema de secreción tipo I PrsDE (SSTI) que comparten al menos un dominio Ra/CHDL (cadherina-like). Se ha demostrado que algunos de estos sustratos están involucrados en el desarrollo de la matriz del biofilm ya sea por clivaje del polisacárido que emerge de la superficie de la célula (las glicanasas Ply) o alterando las propiedades adhesivas de la bacteria (proteínas RapA). En esta tesis se demuestra que una nueva proteína Rap (RapD) se libera completamente al medio extracelular co-secretada con otras proteínas Rap de manera PrsDE dependiente. Más aún, en biofilms se encontraron niveles extracelulares incrementados de RapD en condiciones de cultivo que favorecen la producción de EPS. No se observaron fenotipos evidentes asociados a las propiedades adhesivas o formación de biofilms en la mutante deficiente en rapD. Sin embargo, por cromatografía de exclusión molecular del EPS producido por la cepa silvestre (wild type) de R. leguminosarum bv viciae 3841, las mutantes isogénicas simples rapA2 y rapD y la doble mutante rapA2rapD, se demostró que ambas proteínas Rap tienen un rol en la regulación del tamaño de las cadenas del EPS que se libera al medio extracelular. Los estudios biofísicos indicaron que el calcio gatilla cambios conformacionales en la proteína RapD hacia una estructura dominada por láminas β, como ocurre en las cadherinas. Más aún, la presencia de calcio induce la multimerización de RapD mientras que el agregado de EPS indujo cambios conformacionales adicionales en la proteína. Estudios de ELISA y BIA (binding inhibition assay) indicaron que RapD se une específicamente al EPS y que la galactosa estaría involucrada en esa interacción. Estas observaciones indican que RapD es una proteína lectina que interacciona con calcio y que es capaz de establecer multímeros y modificar las propiedades del EPS, el principal componente estructural de la matriz del biofilm del rizobio.
Rhizobium leguminosarum synthesizes an acidic polysaccharide mostly secreted to the extracellular medium (EPS) and partially retained on the bacterial surface as a capsular polysaccharide (CPS). Rap proteins, extracellular protein substrates of the PrsDE type I secretion system (TISS) share at least one Ra/CHDL (cadherin-like) domain and are involved in biofilm matrix development either by cleaving the polysaccharide (Ply glycanases) or by altering the bacterial adhesive properties. Here, we show that a new Rap protein (RapD) is completely released to the extracellular medium and cosecreted with the other Rap proteins in a PrsDE-dependent manner. Furthermore, high levels of RapD secretion were found in biofilms under conditions that favor EPS production. Interestingly, size exclusion chromatography of the EPS produced by the ΔrapA2 ΔrapD double mutant showed a profile of EPS molecules of smaller size than those of the single mutants and the wild type strain, suggesting that both RapA2 and RapD proteins influence EPS processing on the cell surface. Biophysical studies showed that calcium triggers proper folding and multimerization of recombinant RapD. Besides, further conformational changes were observed in the presence of EPS. ELISA and BIA (binding inhibition assay) assays indicated that RapD specifically binds the EPS and that galactose residues would be involved in this interaction. Taken together, these observations indicate that RapD is a biofilm matrix-associated multimeric protein which binds calcium and that influences the properties of the EPS, the main structural component of the rhizobial biofilm.
Fil: Tarsitano, Julián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.