Parcial purificación y caracterización de una enzima lisosomal de T. Cruzi : [alfa]-manosidasa - Debenedetto, Néstor Fernando (1989)
El desconocimiento acerca del mecanismo por el cual las proteínas lisosomales llegan A asta organela en Trypanosomátidos llevó a la idea de la purificación de la α-manosidasa lisosomal de T,ermazj. Esto permitiría luego de su secuenciación la comparación con otras enzimas lisosomales en T.crumzi en la búsqueda de secuencias en común que pudieran servir como señal parz su transporte a la organela. El trabajo con α-manosidasa se vio inicialmente dificultado por una fuerte pérdida de actividad durante su conservación, por esto, los primeros ensayos se orientaron a la búsqueda de condiciones de almaconaemiento que evitara la rápida disminución de la capacidad catalítica. Mediante estos, se encontró que He habría actividad de proteasa en el material de partida y que la concentración de proteinas no afectaria la conservación de la actividad. Finalmente se encontró que la conservación de la α-manosidasa a 4%C en presencia de 10 mi de B-mercaptoetanol resultaba apropiada para el desarrollo del trabajo. La α-manosidasa mostró afinidad por la Concanavalina-A, de lo que se deduce que es una glicoproteína de alta Manosa. El pH de máxima actividad fue de 4,5 lo que sugiere que la α-manosidasa estudiada es lisosomal. La enzima conservó gran parte de su actividad después de incubarse 2 h. a 0°C y a 37°C a pH superiores a 4. A pH inferiores a este la estabilidad cayó bruscamente luego de la incubación a las dos temperaturas. El cáleulo del PH de la enzima nativa que se realizó por filtración molecular a través de dos columnas distintas no dio resultados coincidentes, aunque en ambos Casos se obtuvieron dos picos de actividad. El EM correspondiente a la filtración en FPLC dio un pico de 200.000 y otro de 220.000. Con el esquema de purificación seguido no se alcanzó a obtener la enzima purificada a homogeneidad. El rendimiento fue del 2,2% y la α-manosidasa al final del proceso resultó con un grado de purificación igual a 359.