La preservación multiobjetivo de alimentos : Efecto de factores tradicionales y emergentes en la respuesta de Aspergillus flavus - López-Malo Vigil, Aurelio (2000)
El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la interacción de distintos factores de estrés (aw, pH, antimicrobianos sintetizados químicamente o antimicrobianos naturales y sus mezclas binarias) en larespuesta de crecimiento de Aspergillus flavus y determinar las condiciones de combinación inhibitoriassinérgicas o de cooperación de dichos factores, con miras a generar modelos predictivos para la conservaciónmultiobjetivo de alimentos. Se determinó el efecto de distintas combinaciones de factores de estrés, tales como actividad de agua (0,99 o 0,95), pH (4,5 o 3,5) y presencia de antimicrobianos sintetizados artificialmente (benzoato de sodio, bisulfitode sodio o sorbato de potasio) y/o antimicrobianos naturales (vainillina, eugenol, carvacrol, timol o citral)sobre la respuesta de crecimiento de Aspergillus flavus. Se formularon sistemas modelo tomando como mediobase al agar papa-dextrosa adicionando las cantidades necesarias de sacarosa y ácido clorhídrico para ajustarla actividad de agua y el pH según el caso y adicionando desde 100 hasta 1,800 ppm de los antimicrobianosen forma individual o en combinaciones binarias de los antimicrobianos. En cada caso los medios sólidosfueron inoculados con 2 μL de una suspensión de esporas del moho y se registró el tiempo para detectar elinicio del crecimiento de la colonia y/o su cambio en diámetro en función del tiempo de incubación. En los sistemas formulados con algún agente antimicrobiano y donde el moho se desarrolló, la velocidad decrecimiento radial varió de 0,037 (a.w 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) a 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100ppm benzoato de sodio). El tiempo lag se incrementó conforme aumentó la concentración del agenteantimicrobiano, por ejemplo, el tiempo lag se alargó aproximadamente 330 horas (cerca de 14 días) enmedios formulados con 200 ppm de timol, aw 0,99 y pH 3,5 y con 300 ppm de este agente el tiempo paradetectar la presencia del moho se retraso 1400 horas (más de 55 días). Se determinaron las concentracionesmínimas inhibitorias de antimicrobianos comunes y naturales para Aspergillus flavus, mostrándose cuando seutilizó benzoato de sodio, bilsulfito de sodio o sorbato de potasio, una dependencia en el valor de pH, y estadependencia fue más notoria a valores de aw altos (0,99). A valores de aw bajos (0,95), se observó lainteracción de la presencia de 300 ppm sorbato de potasio y un pH de 4,5 en la inhibición del moho. Elsorbato de potasio junto con carvacrol y timol fueron los antimicrobianos más efectivos para estacombinación aw- pH. Se modeló utilizando el modelo de Fermi la respuesta a la dosis (cantidad de agenteantimicrobiano) para todas las combinaciones antimicrobiano - pH - aw evaluadas. La respuesta del moho seexpresó como el cociente entre el tiempo lag con respecto al tiempo lag del sistema control mostrando latípica forma sigmoide de las curvas de respuesta a la dosis. Se observaron diferencias importantes en losvalores de los coeficientes de la fución de Fermi (Pc y k) para los diferentes agentes antimicrobianos, asícomo para los distintos valores de aw y pH evaluados. Los resultados mostraron que las concentraciones delos agentes antimicrobianos naturales necesarias para duplicar el tiempo lag que se obtiene en el sistemacontrol no dependen tanto del pH del sistema, como en el caso de los agentes antimicrobianos sintéticos. Se determinó la interacción entre los distintos factores cuando se aplicaron en distintos niveles sobre lainterferencia de la homeostasis de Aspergillus flavus y se determinaron condiciones sinérgicas o decooperación para la inhibición y retraso en el crecimiento del moho, evaluando la respuesta de Aspergillusflavus a diferentes mezclas binarias de antimicrobianos comunes y naturales. No se observó crecimiento delmoho a tiempos de incubación largos conforme se aumentó la concentración de los agentes antimicrobianosen la mezcla. Se observaron también importantes diferencias en el comportamiento del moho en los mediosformulados con distinto valor de pH, así como entre las diferentes mezclas de agentes antimicrobianos. Lasmezclas de los distintos agentes retrasaron el crecimiento al menos 5 días en muchos de los casos, resaltandoel comportamiento de las mezclas con citral en donde se observó que en el 58% de los casos (274 de un totalde 474) a pH 3,5 y en el 53% (253 de 474) a pH 4,5 las observaciones fueron de no crecimiento después de 5días y de crecimiento a los 30 días de incubación. Cada uno de los resultados de las observaciones delcrecimiento o no crecimiento de Aspergillus flavus se representaron mediante un isobolograma, utilizandopara las diferentes condiciones de pH (4,5 o 3,5) y períodos de incubación(5, 10, 15 o 30 días), lasconcentraciones fraccionales inhibitorias (CFI) de cada agente en la mezcla. Los CFI índices (calculadoscomo la suma de los CFI de cada agente en la mezcla) para las combinaciones de agentes antimicrobianosevaluados después de 30 días de incubación, variaron de 0,125 (pH 4,5; 50 ppm timol y 800 ppm vainillina) a 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral y 50 ppm timol). Los CFI índices mostraron comportamientos de sinergismo,aditividad o antagonismo dependiendo de los agentes y sus niveles en las diferentes mezclas, y también deltiempo de incubación. Se realizaron experimentos que permitieron el modelado matemático (probabilístico) de la interfase entrecrecimiento y no-crecimiento de Aspergillus flavus bajo diferentes condiciones de actividad de agua (0,98; 0,96 o 0,94), pH (5,0; 4,0 o 3,0), temperatura de incubación (15 o 25°C) y concentración (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) de benzoato de sodio o vainillina. Los resultados se interpretaron utilizando modelospredictivos con miras a ser utilizados en la conservación multiobjetivo de alimentos, evaluando lasupervivencia del moho a los diferentes factores y prediciendo las condiciones letales y/o inhibitorias. Seobservó un efecto importante del tiempo de incubación, ya que combinaciones inhibitorias del crecimiento delmoho a tiempos cortos resultaron positivas (crecimiento) con tiempos de incubación más prolongados,demostrando el efecto sobre el tiempo lag de A. flavus de los factores empleados en las distintascombinaciones estudiadas. Utilizando regresión logística se obtuvo un modelo polinomial con alto porcentajede concordancia entre los datos (>93%) además las pruebas de Hosmer y Lemeshow y de Chi-cuadradodieron resultados significativos, lo que demuestra la bondad en el ajuste del modelo propuesto para predecirla respuesta (probabilidad de crecimiento) de Aspergillus flavus. El modelo permitió calcular la probabilidadde crecimiento del moho cuando fue inoculado en medios formulados con distintos valores de aw, pH,concentraciones de benzoato de sodio o vainillina e incubado por diferentes tiempos a distintas temperaturas. Se observó que la probabilidad de crecimiento del moho disminuyó conforme disminuyó la temperatura deincubación, el pH y la aw y conforme aumentó la concentración de los agentes antimicrobianos. Laprobabilidad de que el moho se desarrollara fue menor en los casos en los que el medio contenía benzoato desodio. El modelo logístico permitió predecir la respuesta del moho bajo diferentes combinaciones de lasvariables si se establecía un nivel de probabilidad para que el evento (crecimiento) ocurriera. Al disminuir elvalor de probabilidad los niveles de las variables empleadas en la combinación deberían ser más severos;menor temperatura de incubación, menor pH, menor aw, mayor concentración de agente antimicrobiano omenor tiempo de incubación o el uso de vainillina como antimicrobiano, para asegurar con esa probabilidadque el evento ocurriera (o con el complemento de la probabilidad que el evento no ocurriera).