Caracterización de transportadores de aminoácidos en Echinococcus granulosus

• Autores: Camicia, Federico
• Año de publicación: 2011
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rosenzvit, Mara Cecilia
• Materia: ECHINOCOCCUS GRANULOSUS; TRANSPORTADORES DE AMINOACIDOS; DAACS; EAAT; EGAT; GLUTAMATO; QUISTE HIDATIDICO; ECHINOCOCCUS GRANULOSUS; AMINO ACID TRANSPORTERS; DAACS; EAAT; EGAT; HYDATID CYST; GLUTAMATE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Echinococcus granulosus es un pequeño parásito cestode cuyo estadío larval causa la equinococcosis quística o hidatidosis. El objetivo de esta tesis fue analizar el transporte de aminoácidos en el estadío de metacestode y diseccionar los componentes moleculares involucrados en el mismo. Los análisis bioinformáticos realizados han mostrado que en Echinococcus spp. los transcriptos codificantes para transportadores de aminoácidos de la familia DAACS (transportadores de aminoácidos/ dicarboxilatos y catión) se encuentran entre los más representados, siendo los transportadores de aminoácidos excitatorios los más expresados dentro de los miembros de esta familia. Los ensayos de transporte efectuados en quistes hidatídicos infértiles indican que la incorporación de glutamato se daría mediante difusión simple, lo cual sugiere que dicho aminoácido podría ser sintetizado endógenamente. Este resultado estaría en concordancia con el hallazgo bioinformático de genes codificantes para enzimas que intervendrían en la síntesis de novo del aminoácido glutamato. Los análisis transcriptómicos sugieren que habría un aumento muy importante en la expresión de transportadores a nivel del parásito adulto con respecto a la forma lavaria, lo cual sugiere que en el estadío adulto la incorporación de glutamato en forma mediada podría ser esencial. Así mismo, en el protoescólex se han identificado ADNs copia codificantes para transportadores de aminoácidos que podrían estar involucrados en dicho transporte y se han denominado egat1-4. Con el fin de caracterizarlos, se han clonado y determinado las secuencias completas de los ADNs copia correspondientes y se ha hallado que poseen similaridad de secuencia y estructura con miembros de la familia DAACS. Los ensayos de hibridación in situ mostraron que el mensajero de egat1 se localiza en la zona tegumentaria del protoescólex y el correspondiente de egat3 en células del parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. Los anticuerpos contra fragmentos de EgAT1 y EgAT2 reconocieron proteínas en extractos del metacestode en ensayos de Western-blot. Se ha observado que EgAT1 se localiza en el subtegumento del protoescólex, ventosas, almohadilla rostelar y en fibras internas. EgAT1 también se localiza en capa germinal y en el subtegumento del parásito adulto. Por otro lado, EgAT2 se localiza en el parénquima del protoescólex y en brotes de la capa germinal. La diferente expresión espacial y temporal de los transportadores de aminoácidos analizados sugiere que cada uno de ellos cumpliría con las distintas necesidades de aminoácidos en diferentes territorios celulares y/o estadíos del ciclo de vida del parásito. EgAT1 se logró expresar en células de mamífero y los estudios funcionales efectuados en dichas células mostraron un pequeño pero significativo nivel de transporte de glutamato. La expresión de los transportadores a lo largo del ciclo de vida del parásito, su localización en estructuras claves para la interacción con el hospedador, su capacidad aunque limitada de incorporar glutamato, junto a las diferencias de estructura primaria y secundaria con sus ortólogos en mamíferos sugieren que estas moléculas podrían ser blancos de drogas contra la hidatidosis, además de proveer las bases moleculares para profundizar en la biología del parásito en lo que respecta al intercambio de metabolitos con el hospedador.
Echinococcus granulosus is a small parasitic cestode whose larval stage causes cystic echinococcosis or hydatidosis. The aim of this thesis was to analyse the amino acid transport in the metacestode stage and characterise the involved molecules. Bioinformatic analysis performed in Echinococcus spp showed that the transcripts coding for amino acid transporters of the DAACS family (Dicarboxylate/Amino Acid Na+ and/or H+ Cation Symporter family) are among the more represented, being the excitatory amino acid transporters the more expressed among the members of this family. Transport assays have shown that infertile hydatid cysts incorporate the amino acid glutamate from the external milleu by simple difussion. This is in concordance with the bioinformatic finding of the genes encoding enzymes possibly involved in glutamate synthesis. However, the transcriptomic analyses suggest an important increase in the expression levels of amino acids transporters in the adult form and this could imply that glutamate uptake is essential in the adult stage. Also, in the protoscolex stage, cDNAs encoding amino acid transporters were identified and named egat1-4. The corresponding cDNAs were cloned and their sequences were determined. The bioinformatic analyses revealed that they have sequence and structure similarity to DAACS family members. The in situ hybridization labelling indicates the distribution of egat1 mRNA throughout the tegument and egat3 mRNA in parenchimal cells of the protoscolex as well as in buds of the germinal layer. Monospecific polyclonal antibodies against the hydrophilic portions of EgAT1-3 were obtained from which only anti-Egat1 and anti-EgAT2 recognised metacestode proteins by Western-blot. These antibodies showed that EgAT1 protein is localized in the subtegumental region of the metacestode, particularly around suckers and rostellum of protoscoleces and in internal fibers compatible with nervous or muscular structures. EgAT1 was also localised in the germinal layer of the metacestode and in the subtegumental region of the adult worm. EgAT2 was localised in the parenchima of the protoscolex and in buds of the germinal layer. The differencial spatial and temporal expression of the amino acid transporters analysed in this thesis, suggest that each of them fulfil the specific amino acid requirements of the different cellular territories and/or life cycle stages. In addition, EgAT1 was expressed in mammal cells in which functional studies were performed. These studies showed a low but significant glutamate transport level. The low level of transport detected in this system could be due to the difficulty of the mammal cells to get the correct folding, subcellular location and post-translational modifications of the heterologous protein. The expression of the E. granulosus amino acid transporters all along the life cycle, their localisation in organs like suckers and rostellum, which are of major importance for the survival in the final host, and in buds of the germinal layer which give rise to protoscoleces, together with the capacity to transport glutamate and the structural differences with their mammal orthologous, suggest that these molecules could be amenable target for antihelmintics. The results obtained in this thesis could also help to understand the molecular basis of the metabolites interchange between the parasite and their hosts.
Fil: Camicia, Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.