Evaluación de la potencialidad de la lechuga como plataforma para el mejoramiento de especies astráceas. Análisis de la respuesta de plantas sobreexpresantes del péptido antimicrobiano SNAKIN-1 frente a estreses bióticos y abióticos - Darqui, Flavia Soledad (2017)
La lechuga (Lactuca sativa L.) es una de las hortalizas más consumidas a nivel mundial. En Argentina se produce en casi todo el país, en los cinturones verdes de las grandes ciudades. Su sistema de producción es descentralizado, requiere mucha mano de obra y se realiza durante todo el año gracias al cultivo bajo cubierta. Por estas características es el cultivo más utilizado en la Agricultura Familiar. Se consumen las hojas frescas, por lo que es una hortaliza perecedera de baja competitividad, que no puede ser almacenada o transportada durante largos períodos de tiempo, estando los centros de producción a corta distancia de los lugares de consumo. Su producción es intensiva, se realiza tres o cuatro veces al año en el mismo sitio, lo que facilita la aparición de plagas y enfermedades. Las enfermedades foliares, principalmente las de origen fúngico, reducen la producción y afectan severamente el valor comercial del cultivo. El intento de controlar a estos patógenos suele llevar a un abuso en la aplicación de agroquímicos, lo que conduce a un alto impacto ambiental, mayores costos y un alto riesgo sanitario de exceder los niveles permitidos de estas sustancias en los productos cosechados. La lechuga es una especie modelo en biotecnología, dada su buena respuesta al cultivo de tejidos y al desarrollo de un sistema de transformación estable que ha permitido la introducción de diversos genes en el cultivo, y ha sido propuesta como el sistema modelo de transformación genética del grupo taxonómico Asteraceae. Snakin-1, péptido antimicrobiano aislado de papa, ha demostrado su actividad antimicrobiana de amplio espectro in vitro e in vivo, tanto en el sistema homólogo papa como en sistemas heterólogos. En este contexto, y con el objetivo de evaluar la potencialidad de la lechuga como sistema modelo para ensayar la obtención de plantas resistentes a patógenos mediante su transformación con genes antimicrobianos heterólogos, se evaluó si la sobreexpresión de Snakin-1 era capaz de conferir tolerancia y/o resistencia a patógenos en plantas transgénicas de lechuga. En este trabajo, se llevaron a homocigosis cinco eventos de transformación portando los genes 2 snakin-1 y nptII y se caracterizaron molecular y biológicamente. La presencia y la estabilidad de la construcción génica fue confirmada por un análisis de Southern blot en la filial T3 y mediante la observación del fenotipo de resistencia a kanamicina hasta la filial T5. El nivel de, expresión de snakin-1 en cada línea se determinó mediante ensayos de RT-qPCR y Western blot. Las líneas transgénicas, en comparación con las no transgénicas tuvieron semillas de mayor tamaño, una elongación más lenta de la radícula durante la germinación y hojas con mayor índice de circularidad. En algunas líneas los tallos presentaron un mayor grosor y una menor elongación, produciendo plantas más compactas. En algunas líneas transgénicas se detectó una menor acumulación de ROS. También, se detectaron diferencias entre las líneas transgénicas y la línea no transgénica bajo estrés térmico, tanto en la germinación de las semillas como en la elongación de las plantas adultas. Los desafíos con fitopatógenos se realizaron con los hongos Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum. En ensayos in vitro en placas conteniendo extracto proteico de plantas transgénicas, se registró una inhibición del crecimiento de R. solani, demostrando que el extracto crudo de planta transgénica pudo reducir el crecimiento del hongo en forma directa, por acción del péptido Snakin-1. Por otro lado, las líneas con mayor sobreexpresión del transcripto snakin-1, demostraron una mejor respuesta en el desafío in vivo frente a R. solani, tanto en ensayos con plántulas in vitro como en plantas en invernáculo. También, dos de esas mismas líneas mostraron una protección significativa frente a S. sclerotiorum en ensayos de desafío en plantas adultas. Se pudo identificar una línea (2.2B) con buena respuesta a estrés biótico y abiótico. Nuestros resultados muestran la actividad de amplio espectro del péptido antimicrobiano Snakin-1 en lechuga, tanto in vitro como in vivo, dependiente del nivel de expresión del transgén. Esto refleja tanto la capacidad biotecnológica del péptido Snakin-1 como la utilidad de la lechuga como planta modelo dentro de la familia Asteraceae para la evaluación de genes de interés agronómico.