Clonado molecular del genoma del virus de la fiebre aftosa - Andino, Raúl Héctor (1986)
A partir de RNA genomico del virus de la fiebre aftosa (VFA), cepa O1 Campos, se sintetizó DNA copia (CDNA) utilizando los metodos de Nucleasa S1 y RNasa H alternativamente. Mediante los procedimientos de "tailing" o "blunt end ligation" dicho cDNA fue ensamblado a plasmidos vectores (pBR322 o pAT153 PvuII/8), obteniendose de esta manera una serie de recombinantes los cuales fueron clonados por transformación en Escherichia Coli. Los clones obtenidos fueron seleccionados por hibridización en colonias, utilizando como "probes" RNA viral o determinados fragmentos de cDNA obtenidos previamente. El analisis de los clones seleccionados mediante enzimas de restricción y secuenciación de DNA indicó que la suma de los insertos de 5 clones representa todo el fragmento "L" del RNAgenómico (8000 bases). Posteriormente se obtuvo la secuencia de nucleótidos correspondiente al "gen" de Vp1, con dichos datos de secuencia se dedujó la estructura primaria del polipeptido Vp1. La comparación de la secuencia aminoacídica de la cepa 01 Campos con las secuencias de otras cepas (A10, O1K y C1) mostró la existencia de tres zonas de variabilidad, correspondientes a los residuos aminoacidicos 40-60, 134-160 y 195-213, de las cuales dos se encuentran en regiones hidrofílicas, mientras que la tercera se halla en un dominio hidrfóbico. El fragmento de cDNA correspondiente al "gen" de Vp1 fue subclonado dentro del vector de transposición miniMu denominado PR13, obteniendose el plásmido pmMVp1, el cual permite que el "gen" de Vp1 sea movilizado por transposición de un replicón a otro. Mediante dicha transposición se obtuvieron péptidos de fusión formados por Vp1 y ciertas proteínas de la placa basal del fago T4, los cuales presentan, en forma transitoria, los epitopes inmunogénicosde Vp1 en la superficie celular bacteriana.