Mecanismos moleculares de acción del sistema CRH/CRHR1 : activación de la vía de Akt en un contexto neuronal - Dos Santos Claro, Paula Ayelén (2022)
La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol central en la respuesta neuroendocrina y comportamental al estrés, dirigiendo la activación del eje hipotálamo- hipófisis-adrenal y actuando como neuromodulador en el sistema nervioso central. Su desregulación se relaciona con desórdenes psiquiátricos y con el inicio de procesos neurodegenerativos. Nuestro objetivo es definir las vías de señalización de CRH por el receptor CRHR1 y los componentes moleculares involucrados, con potencial relevancia terapéutica en desórdenes ligados a estrés. CRHR1 es un GPCR clase B que se encuentra generalmente acoplado a proteína Gs, por lo que su activación promueve el aumento intracelular del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc) y la consecuente activación de diversas cascadas de señalización. Hasta el momento, la vía de las MAP quinasas (MAPKs) fue la más estudiada río abajo de este receptor. En trabajos previos hemos descripto que el CRHR1 activa mecanismos dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis, los cuales se evidencian en la activación bifásica de la MAPKs ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 que expresa el receptor de CRH tipo 1 (HT22-CRHR1). Hemos demostrado además que existen dos fuentes de AMPc asociadas a la activación del CRHR1, que involucran no solo a las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también a la adenilil ciclasa soluble (sAC). Ambas fuentes participan en la fase aguda de activación de ERK1/2 pero solo sAC es esencial para la activación sostenida de esta quinasa. Como se ha descripto recientemente para un grupo de GPCRs, el CRHR1 activado continúa señalizando luego de su internalización. Akt es una serin/treonin quinasa presente en la mayoría de los tejidos, cuya actividad media procesos celulares diversos como el crecimiento, la proliferación y el metabolismo. En el cerebro, la vía de Akt tiene implicancias en la respuesta a estrés, la neurotransmisión y la plasticidad sináptica. A su vez, se ha descripto que el efecto antidepresivo de numerosas drogas es mediado por la cascada de PI3K-Akt. En este trabajo nos propusimos evaluar si la vía de PI3K-Akt estaba involucrada en la señalización del sistema CRH/CRHR1 y si existía un crosstalk con la ya descripta cascada de MAPKs. En las HT22-CRHR1, Akt se fosforila en respuesta al estímulo de CRH y esta fosforilación es dependiente del pool de AMPc generado por la sAC. Sin embargo, esta activación no depende de los efectores clásicos de AMPc (PKA y EPACs) sino que parece estar mediada por la proteína quinasa Src. En base al estado de fosforilación de diversos sustratos pudimos determinar que el Akt fosforilado (pAkt) es funcional en estas células. El perfil de activación de Akt resultó ser opuesto al de ERK1/2 lo cual sugería una posible conexión entre estas vías. La inhibición farmacológica de MEK no tuvo efecto sobre la activación de Akt, mientras que inhibir tanto PI3K como Akt disminuyó los niveles de ERK1/2 fosforilado (pERK1/2) en respuesta a CRH. Por el contrario, la inhibición de la vía PI3K-Akt llevó a un aumento de la respuesta global de AMPc mediada por CRH y de CREB fosforilado (pCREB). Teniendo en cuenta que la activación de Akt solapa temporalmente con la segunda fase de activación de ERK1/2 que es dependiente de la endocitosis, evaluamos los niveles de pAkt en células en las que la internalización fue bloqueada. Determinamos que al igual que para ERK1/2, la endocitosis del CRHR1 es crucial para la fosforilación de Akt. Mediante el análisis de colocalizaciones entre el receptor y marcadores de distintos compartimentos de vesículas y organelas de membrana, exploramos la identidad de las estaciones por las que transita el CRHR1 luego de su internalización. CRHR1 activado se detecta en endosomas tempranos (Rab5+), de reciclado (Rab11+) y en un compartimento sintaxina-6 positivo. CRHR1 colocaliza además, con los efectores de Rab5 APPL1 y EEA1. En HT22-CRHR1 silenciadas establemente mediante el uso de shRNAs, la depleción de APPL1 disminuyó los niveles de pAkt sin afectar la fosforilación de ERK1/2 en respuesta a CRH, mientras que la pérdida de EEA1 tuvo el efecto contrario. Estos resultados indican que la vía de PI3K-Akt se activa río abajo del CRHR1 en un contexto neuronal y que existe un crosstalk entre Akt y ERK1/2. Por otra parte, el hecho de que la fosforilación de Akt sea dependiente de la internalización del receptor y de la proteína endosomal APPL1, refuerza la idea de que el CRHR1 activado señaliza desde compartimientos intracelulares.