Evaluación de sistemas de expresión heterólogos para la producción de factores de crecimiento humanos recombinantes

• Autores: Müller, Carolina
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Segretin, María Eugenia; Wirth, Sonia Alejandra
• Materia: FACTORES DE CRECIMIENTO; BIORREACTORES VEGETALES; EXPRESION TRANSITORIA; PLANTAS TRANSPLASTOMICAS; CLOROPLASTOS; NICOTIANA TABACUM; NICOTIANA BENTHAMIANA; CELULAS MADRE; MAMMALIAN STEM CELLS; NICOTIANA BENTHAMIANA; NICOTIANA TABACUM; CHLOROPLASTS; TRANSPLASTOMIC PLANTS; TRANSIENT EXPRESSION; PLANT-BASED BIORREACTORS; GROWTH FACTORS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los factores de crecimiento son proteínas claves para el mantenimiento de cultivos de células madre in vitro, ya que regulan la proliferación y diferenciación celular. Dada la importancia de las células madre y su potencial aplicación en terapias regenerativas, resulta de especial interés desarrollar plataformas de expresión que permitan una producción segura y a bajo costo de factores de crecimiento recombinantes. El uso de plantas como biorreactores constituye un sistema atractivo para la producción de proteínas recombinantes, debido a su capacidad para alcanzar niveles potencialmente altos de expresión, los mínimos requerimientos para su crecimiento y el fácil escalado. Por otro lado, la expresión en levaduras se destaca como un sistema de producción rápido y costo-efectivo, con un gran potencial para la producción de proteínas de origen eucariota. En el marco de esta Tesis doctoral, ensayamos distintos sistemas de expresión para producir factores de crecimiento recombinantes, evaluando la expresión en la levadura Pichia pastoris y dos sistemas de plantas como biorreactores: la transformación del genoma plastídico de Nicotiana tabacum y la expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Evaluamos la producción del Factor de Crecimiento Fibroblástico básico humano (hFGFb) en los tres sistemas mencionados, y de la Proteína Morfogénetica Ósea humana (hBMP4) específicamente en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Se ensayaron distintas condiciones de crecimiento e inducción para la producción de rhFGFb y rhBMP4 en cultivos de la levadura P. pastoris. Sin embargo, no fue posible producir las proteínas de interés bajo las condiciones analizadas, y se enfocó el estudio al análisis de los distintos biorreactores vegetales. A través de la transformación del genoma plastídico se obtuvieron plantas transplastómicas que, a pesar de exhibir alteraciones fenotípicas, expresaron de forma estable la proteína rhFGFb, alcanzando niveles de expresión de 0,3% de la proteína total soluble (PTS). Se logró purificar rhFGFb biológicamente activo a partir de las plantas transplastómicas, corroborando su actividad biológica en un ensayo de proliferación celular. Por otro lado, se evaluó la expresión transitoria en plantas de N. benthamiana y se estudió la acumulación de la proteína rhFGFb en distintos compartimentos subcelulares. El apoplasto, la vacuola y el retículo endoplasmático resultaron compartimentos subcelulares adecuados para la acumulación de la proteína recombinante. De los sistemas estudiados, la transformación del genoma plastídico se presenta como el más prometedor, permitiendo producir rhFGFb biológicamente activo en grado de pureza y cantidad suficientes para su potencial aplicación en cultivos de células madre. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial de los biorreactores vegetales para la expresión de factores de crecimiento recombinantes.
Growth factors are crucial proteins for maintaining stem cell cultures in vitro, regulating both cell proliferation and differentiation. Given the relevance of stem cells and their potential applications in regenerative therapies, it is of special interest to develop expression platforms that enable the safe and cost-effective production of recombinant growth factors. The use of plants as bioreactors represents an attractive system for the production of recombinant proteins, due to their ability to achieve potentially high expression levels, their minimal growth requirements and scalability. On the other hand, yeast expression stands out as a rapid and cost-effective production system with great potential to produce eukaryotic-derived proteins. In this doctoral Thesis, we studied different platforms to produce recombinant growth factors, evaluating the expression in the yeast Pichia pastoris and two plant bioreactor systems: plastid genome transformation of Nicotiana tabacum and transient expression in Nicotiana benthamiana. We evaluated the production of human basic Fibroblast Growth Factor (hFGFb) in the three aforementioned systems. Additionally, we assessed the production of human Bone Morphogenetic Protein (hBMP4) specifically in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Different growth and induction conditions were tested for the production of rhFGFb and rhBMP4 in P. pastoris cultures. However, it was not possible to produce the proteins of interest under the analyzed conditions. Therefore, we focused our study on the analysis of plant-based bioreactors. Through plastid genome transformation, we obtained transplastomic plants which, despite exhibiting phenotypic alterations, stably expressed the rhFGFb protein and reached expression levels of 0.3% of the total soluble protein (TSP). Biologically active rhFGFb was purified from the transplastomic plants, confirming its biological activity in a cell proliferation assay. On the other hand, we evaluated rhFGFb transient expression in N. benthamiana plants, and studied the accumulation of the recombinant protein in different subcellular compartments. The apoplast, vacuole, and endoplasmic reticulum were suitable subcellular compartments for the accumulation of the rhFGFb. Among the studied systems, plastid genome transformation was the most promising system for rhFGFb production, allowing the production of biologically active rhFGFb in sufficient purity and quantity for its potential application in stem cell cultures. Overall, these results underscore the potential of plant bioreactors for the expression of recombinant growth factors.
Fil: Müller, Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.