P19INK4D y su fosforilación secuencial son críticas para el mantenimiento de la integridad del genoma

• Autores: Marazita, Mariela C.
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cánepa, Eduardo Tomás; Pignataro, Omar Pedro
• Materia: CICLO CELULAR; P19INK4D; RESPUESTA AL DAÑO AL ADN; REPARACION DEL ADN; FOSFORILACION; CELL CYCLE; P19INK4D; DNA DAMAGE RESPONSE; DNA REPAIR; PHOSPHORYLATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las proteínas INK4 (p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d) componen una familia de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) que funcionan en la fase G1 bloqueando la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. Mientras que comparten similitudes en sus estructuras formadas por repeticiones de motivos ankirina, estas proteínas difieren en sus patrones de expresión durante el desarrollo y en el adulto. Más allá de la aparente redundancia de su función en el control del ciclo celular, algunos de sus miembros han sido involucrados en distintos procesos tales como diferenciación, senescencia y supresión tumoral. En este trabajo demostramos que p19INK4d es inducido por radiación UV en diferentes tipos celulares (células de Leydig MA-10, cultivos primarios de células de Leydig, BHK-21 y WI-38) y que la inducción es específica de este miembro de la familia. Planteamos que la inducción podría implicar una posible participación de p19INK4d en la reparación del ADN. Mediante diversas estrategias, establecimos que p19INK4d efectivamente tiene una función en este proceso. Además, frente a daño genotóxico la disminución en los niveles de p19INK4d aumentó el número de aberraciones cromosómicas, concluyendo que la actividad de p19INK4d afecta el mantenimiento de la integridad del genoma. Sumado a esto, las células con niveles reducidos de p19INK4d resultaron con menor capacidad de sobrevivir al tratamiento con radiación UV. En respuesta al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales que involucran diversas proteínas quinasas. Estas quinasas activan a su vez diferentes sustratos efectores de la respuesta conduciendo a la reparación, o no, del daño. Habiendo descripto una función de p19 en este proceso el siguiente objetivo consistió en estudiar si p19 formaba parte de este grupo de proteínas efectoras fosforiladas frente al daño. Encontramos que p19 es fosforilada por agentes que inducen diferentes tipos de daño (radiación UV, péptido β-amiloide y cisplatino). Identificamos dos sitios de fosforilación, serina 76 y treonina 141, los cuales son fosforilados en forma secuencial. Los resultados señalan a CDK2 y CDK5 como responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en treonina 141. La fosforilación de ambos sitios ocurre en el citoplasma y la serina 76 es necesaria para la translocación de p19 al núcleo en esta respuesta. Evaluamos luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en estos sitios. Encontramos que tanto la serina 76 como la treonina 141 son estrictamente necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin embargo, mutantes en estos sitios incapaces de ser fosforiladas, mantienen la misma capacidad de inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Esto señala que existe una independencia en la función de reparación respecto de la función inhibitoria de CDK4/CDK6. Por último, iniciamos el estudio referido a las posibles proteínas que interactúan con p19INK4d relacionadas a la función de reparación del ADN. Describimos seis interactores encontrados por análisis de doble híbrido en levaduras que resultan de particular interés porque presentan funciones en procesos comunes a p19INK4d. Estos posibles interactores participan en la reparación del ADN, en la remodelación de la cromatina y en la regulación de factores de transcripción del ciclo celular y la apoptosis. En vista de la participación de p19INK4d en respuesta a diversos agentes genotóxicos, que activan distintos mecanismos de reparación, postulamos que p19INK4d actuaría en la reparación del ADN específicamente en una etapa temprana de la respuesta celular al daño al ADN. El análisis de los potenciales interactores de p19INK4d, luego de la injuria genotóxica, permite sugerir la participación de esta proteína en los complejos remodeladores de la cromatina necesarios para permitir el acceso de las maquinarias de reparación en los sitios de daño.
INK4 proteins are members of a family of cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors that function in G1 to block the activity of CDK4 and CDK6. While they share clear structural similarities, numerous studies have shown that INK4 proteins differ in their expression patterns during development and in the adult, and have differing roles in differentiation, senescence and tumor suppression. We demonstrated that p19INK4d is induced in response to UV radiation in different cell types (Leydig MA-10 cell line, primary Leydig cell culture, BHK-21 y WI-38) and that this induction is specific of this family member. We hypothesized that this fact could be related to a role of p19INK4d in DNA repair. Taking advantage of diverse strategies, we found that p19INK4d effectively participates in this process. Adding to this, diminished p19INK4d levels when cells are exposed to genotoxics leads to an increase in the number of chromosomal aberrations. From these facts we concluded that p19INK4d influences the maintenance of genome integrity. Furthermore, cells with reduced p19 expression resulted in a significant decrease of the survival rate upon UV damage. In DNA damage response different pathways are triggered involving the activity of protein kinases. These kinases in turn activate diverse substrates that act as effectors of the response leading or not to DNA repair. Having described a function of p19INK4d in this process, the next aim leaded the study to analize whether p19INK4d is part of the effector proteins phosphorylated after DNA damage. We found out that p19 is phosphorylated by treatment with agents which induce different types of DNA damage (UV light, β-amyloid peptide and cisplatin). We identified two phosphorylation sites, serine 76 and threonine 141, which are sequentially phosphorylated. Our results pointed out CDK2 and CDK5 as responsible kinases to act on serine 76 and PKA as the one acting on threonine 141. Both sites are phosphorylated in the cytoplasmic space but only serine 76 is required for p19INK4d translocation to the nucleus in this response. We investigate the physiological relevance of the phosphorylation process in these sites. We showed that serine 76 and threonine 141 are strictly necessary for p19 function in DNA repair. However, those mutants of p19 not able to be phosphorylated have full capacity for inhibiting cell proliferation when they are overexpressed. This fact indicates the independence of p19INK4d functions. Lastly, we began the study related to potential proteins interacting with p19INK4d linked to DNA repair. We described six interactors found by a yeast two hybrid screening which appear particularly interesting because they have functions in common processes to p19INK4d. These interactors participate in processes such as: DNA repair, chromatin remodelling and regulation of transcription factors of the cell cycle and apoptosis. Taking into account p19INK4d participation in response to diverse genotoxic agents which activate different DNA repair mechanisms, we finally raised the hypothesis that p19 would be taking part in an early step in DNA damage response, specifically in DNA repair. The analysis of potential p19INK4d interactors, after genotoxic injury, suggests that this protein could play a role as a member of chromatin - remodeling complexes necessary for the accessibility of DNA repair machineries to DNA damaged sites.
Fil: Marazita, Mariela C.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.