Estudio de los mecanismos moleculares de la replicación y patogénesis del virus del Zika

• Autores: Pallarés, Horacio Martín
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Gamarnik, Andrea Vanesa
• Materia: ZIKA; FLAVIVIRUS; sfRNA; RESPUESTA ANTIVIRAL INNATA; INTERFERON; PKR; INTERACCION VIRUS-CELULA; ZIKA; FLAVIVIRUS; sfRNA; INNATE IMMUNE RESPONSE; INTERFERON; PKR; VIRUS-HOST INTERACTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El virus del Zika (ZIKV) es un virus de ARN transmitido principalmente por mosquitos del género Aedes, como el Aedes aegypti. Este virus pertenece a la familia Flaviviridae, género Flavivirus, junto con otros patógenos relevantes para la salud como el dengue, la fiebre amarilla y el virus del Nilo Occidental. Aunque el ZIKV se descubrió en la década de 1940, no fue sino hasta el año 2015 cuando el mundo tomó conciencia de su importancia epidemiológica, debido a una epidemia que comenzó en Brasil y se extendió a numerosos países. El comienzo de esta tesis coincidió con la expansión del ZIKV en el continente americano, momento en el cual se desconocían aspectos fundamentales de la biología de este virus, de su forma de transmisión y, en especial, de su patogénesis. Por este motivo, se inició un estudio de la biología molecular del ZIKV que se transformó en esta tesis doctoral. Este trabajo de tesis abordó tres etapas sobre el estudio de los mecanismos moleculares que gobiernan la replicación y la patogénesis del ZIKV. En primer lugar, se desarrollaron herramientas genéticas inexistentes hasta el momento para manipular al genoma viral y estudiarlo a nivel molecular por técnicas de genética reversa. Así, se construyeron clones infecciosos del ZIKV a partir de aislamientos virales locales. En una segunda etapa, se identificaron elementos de ARN del genoma viral relevantes para la infección. Se llevó a cabo un análisis sistemático sobre las estructuras de ARN presentes en el extremo 3' no codificante (3’UTR) del genoma del ZIKV. Para esto, se construyó una biblioteca de virus recombinantes cuyo fenotipo de replicación fue caracterizado a partir de la infección sobre células humanas y de mosquitos. Así, se identificó el rol fundamental y cooperativo de dos estructuras de ARN en la producción de ARNs virales no codificantes, denominados ARNs subgenómicos de flavivirus (sfRNAs), previamente asociados a la evasión de la respuesta antiviral celular y la patogénesis en infecciones con otros flavivirus. Finalmente, en la tercera etapa, se revelaron los mecanismos moleculares mediante los cuales los sfRNAs modulan la infección del ZIKV. Al respecto, se demostró su capacidad para inhibir la respuesta antiviral innata en células humanas, especialmente afectando la producción y señalización del interferón (IFN) del tipo I. A nivel molecular, se encontró que los sfRNAs activan la quinasa PKR, la cual fosforila el factor eIF2α, inhibiendo la traducción global de ARN mensajeros. Aunque PKR es conocida como un gen antiviral, se demostró que, durante la infección con ZIKV, la activación de esta quinasa mediante sfRNAs es pro-viral. Mediante el uso de la técnica de Ribosome Profiling en células infectadas se descubrió que los sfRNAs modulan la respuesta antiviral inhibiendo la traducción del IFN y de otros genes antivirales. En conjunto, las herramientas genéticas y los hallazgos de esta tesis ofrecen información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la replicación y a la interacción del ZIKV con la célula hospedadora. Además, destacan un mecanismo evolutivo que llevó al ZIKV a generar moléculas de ARN especializadas para reprogramar un sistema antiviral dirigido por PKR en uno que, por el contrario, favorece la infección. Esperamos que el conocimiento generado contribuya al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y preventivas contra las infecciones por el ZIKV.
The Zika virus (ZIKV) is an RNA virus primarily transmitted by Aedes mosquitoes, such as Aedes aegypti. This virus belongs to the Flaviviridae family, Flavivirus genus, along with other relevant human pathogens, including dengue, yellow fever, and West Nile virus. Although ZIKV was discovered in the 1940s, its epidemiological relevance became evident in 2015 during an epidemic that originated in Brazil and spread to other countries. The beginning of this thesis overlapped with the expansion of ZIKV in the Americas, when little was known about the virus's biology, transmission, and pathogenesis. Thus, we initiated a project to better understand this important pathogen, which led to the accomplishment of this doctoral thesis. This work was approached in three stages, undertaking studies about the molecular mechanisms governing ZIKV replication and pathogenesis. First, to manipulate the viral genome and study its functions at the molecular level, genetic tools were developed using reverse genetics techniques. Infectious clones of ZIKV were constructed from local viral isolates that were instrumental to dissect viral functions. In a second stage, we identified RNA elements in the viral genome relevant to infection. A systematic analysis of the RNA structures in the 3' untranslated region (3’UTR) of the ZIKV genome was conducted by constructing a library of recombinant viruses. The replication phenotype of these viruses was characterized through infection in human and mosquito cells. In this process, a fundamental and cooperative role of two RNA structures in the production of non-coding viral RNAs, known as subgenomic flaviviral RNAs (sfRNAs), was identified. These sfRNAs were previously associated with evasion of cellular antiviral responses and pathogenesis in infections with other flaviviruses. Thus, in the third and final stage, we uncovered the molecular mechanisms by which sfRNAs modulate ZIKV infection. We found that sfRNAs are able to inhibit the innate antiviral response in human cells, by reducing the production and signaling of type I interferon (IFN). At the molecular level, we found that sfRNAs activate a kinase known as PKR, leading to the phosphorylation of the eIF2α translation initiation factor and the inhibition of global translation. Despite PKR being known as an antiviral gene, it was shown that, during ZIKV infection, the activation of this kinase by sfRNAs is proviral. Ribosome Profiling in infected cells revealed that this proviral mechanism involves inhibition of translation of type I IFN and other antiviral genes. In conclusion, the genetic tools developed and the information generated provide a better understanding of the molecular mechanisms underlying ZIKV replication and its interaction with the host cell. They also highlight an evolutionary mechanism that led ZIKV to generate specialized RNA molecules to repurpose an antiviral system directed by PKR into one that favors viral infection. I hope that the new knowledge contributes to the development of novel therapeutic and preventive strategies against ZIKV infections.
Fil: Pallarés, Horacio Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.