Estructura y función del dominio D/D de la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae - González Bardeci, Nicolás Diego (2015)
La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una quinasa de serina y treonina deamplio espectro que fosforila a sus proteínas blanco en respuesta a estímulosespecíficos. Se encuentra involucrada en la regulación de una gran diversidad deprocesos fisiológicos en una amplia variedad de organismos, motivo por el cual es unmiembro modelo de estudio de la superfamilia de las Proteínas Quinasa. En la mayoría de los organismos, en condiciones de baja concentración de cAMP existecomo una holoenzima inactiva heterotetramérica conformada por dos subunidadescatalíticas (C) y un dímero de subunidades regulatorias (R). En respuesta a estímulosextracelulares específicos, las concentraciones intracelulares del segundo mensajeroaumentan; como consecuencia, dos moléculas de cAMP se unen a cada subunidad R,generando un cambio conformacional que disocia la holoenzima en un dímero desubunidades R y dos subunidades C activas. En mamíferos existen cuatro isoformas de la subunidad R, que presentan una estructurade dominios bien conservada entre los distintos organismos. Ésta consiste de dosdominios de unión a cAMP hacia el extremo C-terminal, y una región responsable de ladimerización hacia el extremo N-terminal. Esta pequeña región de apenas 50aminoácidos se denomina dominio de dimerización y anclaje (D/D), ya que constituyeademás una superficie de interacción para una familia de proteínas denominadas AKAPs (A-Kinase Anchoring Proteins). Estas proteínas tienen como función proporcionar a laholoenzima de la PKA la localización subcelular necesaria para garantizar lapropagación adecuada de las señales disparadas por cAMP. Todas ellas presentan unahélice anfipática de unos 20 aminoácidos cuya cara no polar interactúa con alta afinidadcon una superficie hidrofóbica proporcionada por los dominios D/D. Se conocen las estructuras de alta resolución de los dominios D/D de mamíferos, tantoen su forma apo como en complejo con péptidos derivados de distintas AKAPs. Sinembargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios estructurales de estosdominios en otros organismos. El objetivo principal de este trabajo consiste en obtener una caracterización estructuraly funcional del dominio D/D de Bcy1, la subunidad R de la PKA de S. cerevisiae. Lamotivación principal radica en contribuir con el primer estudio de estos dominios enorganismos no mamíferos, a efectos de establecer una comparación con éstos. S.cerevisiae es un organismo modelo por excelencia en bioquímica y biología molecular, yresulta muy pertinente para este trabajo dado que en este organismo la PKA es unaenzima fundamental involucrada en la regulación de los procesos relacionados con larespuesta a la disponibilidad de nutrientes, respuesta a estrés, desarrollo y entrada enfase estacionaria. En primer lugar, se realizó un mapeo del dominio D/D de Bcy1 por análisisbioinformático de secuencias y experimentos de entrecruzamiento químico utilizandomutantes de deleción de Bcy1 en su extremo N-terminal. En segundo lugar, se procedióal clonado, sobreexpresión en bacterias, y desarrollo de un protocolo de purificación delfragmento recombinante Bcy1 1-50. Posteriormente, se procedió a su caracterizaciónestructural, para lo cual se utilizaron dos abordajes generales: estudiar la estructura ensolución y elucidar la estructura cristalina. Para la primera parte, se determinó el estado oligomérico en solución y se obtuvieronparámetros hidrodinámicos característicos utilizando cromatografía de exclusiónmolecular (SEC), dispersió n estática de la luz (SLS) y dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Por otro lado, se estudió la estructura secundaria utilizando dicroísmo circular (CD). Finalmente, se construyó un modelo de la estructura en solución consistente conlos datos experimentales, mediante herramientas de modelado molecular. En segundolugar, se logró resolver la estructura cristalina utilizando difracción por rayos X (XRD). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han identificado varias proteínasinteractoras de Bcy1. Estas proteínas son consideradas “candidatas” a ser las primeras AKAPs reportadas en levaduras. Para concluir este trabajo, se estudió la interacciónentre el fragmento Bcy1 1-50 y un péptido sintético derivado de una de estas proteínas, Ira2. Para ello se utilizaron técnicas de dicroísmo circular y espectroscopía defluorescencia.